DNA折り紙回転ラチェットモーター

Nov 05, 2023

Nature volume 607、pages 492–498 (2022)この記事を引用

41k アクセス

36 件の引用

581 オルトメトリック

メトリクスの詳細

分子機構の動きに方向性を与えるには、このような小さなスケールや周囲温度の溶液中に遍在するランダムな熱力を克服する必要があります。エネルギー供給のない平衡状態では、熱力学の法則に違反せずに方向性の運動を維持することはできません。熱力学的平衡から離れた条件下では、反転対称性を破る拡散機構であるブラウンラチェットの枠組み内で方向性運動が達成される可能性があります1、2、3、4、5。ラチェット運動は、F1F0-ATPase6、7、8 などの多くの天然の生物学的モーターの機能を支えていると考えられており、合成マイクロスケールシステムで実験的に実証されています (たとえば、我々の知る限り、最初は参考文献 3)。有機化学合成により作成される人工分子モーターにおける9,10,11,12。 DNA ナノテクノロジー 13 は、ピボット、ヒンジ、クランクスライダー、回転システム 14、15、16、17 など、さまざまなナノスケール機構を生み出しました。これらは、たとえば、鎖置換反応 18、19 や環境パラメーターの変化によって引き起こされる、さまざまな構成を採用できます。 pH、イオン強度、温度、外部場として、またそれらの動きを天然のモータータンパク質の動きと結合させることによって解析されます20、21、22、23、24、25、26。この以前の研究と、低レイノルズ数のダイナミクスと固有の確率性 27,28 の考慮により、ラチェットによって駆動され、その機械的能力が F1F0-ATPase などの生物学的モーターに近い、DNA 折り紙から構築されたナノスケールの回転モーターの開発につながりました。

DNA 折り紙 29,30 の手法を使用して、高さ 40 nm、幅 30 nm の台座を設計および作製し、その上に辺の長さ 60 nm、厚さ 13 nm の正三角形のプラットフォームを固定しました (図 1a-c および補足図1および2)。三角形のプラットフォームの中央空洞を通って突き出ている台座の部分には、ローターアームのドッキングサイトが含まれています。ドッキング部位は、台座上の三角形のプラットフォームの中点近くにある 3 つの不対ヌクレオチドからなるピボットポイントによって固定されています。次に、ローターアームは、全長550 nmの2つの端から端まで接合された剛性ロッドモジュール（それぞれ別のDNA折り紙）で構成されます（図1d、eおよび補足図3）。ローターアームの長さは、回折限界蛍光顕微鏡で個々のモーターの角方向の変化をリアルタイムで追跡できるように、また溶媒との粘性摩擦によって角運動を減速できるように選択されました。これは、キノシタらによる古典的な実験に触発されています。は、個々の F-アクチン標識 F1-ATPase モーターの回転を示しました 8。ロッドモジュールは、ハニカム格子パターンに配置された10個のDNA二重らせんから構成されていました（図1d、e）。このようならせん束は、数マイクロメートルの領域の持続長を有することが以前に示されている 31 。したがって、ローターアームは硬いが弾性のあるロッドとみなすことができます。ローターアームは、ピボットポイントの両側で三角形のプラットフォームの範囲を超えて突き出ています。この設計では、ローターアームは、三角形の平面内でピボット点を中心とした一軸回転に立体的に拘束されます。また、三角形のプラットフォームの 3 つの端に物理的な障害物を設置しました (図 1c)。障害物は、三角形のプラットフォームの表面から約50°の傾きで突き出た長さ18 nmの長方形の板で構成されています。プレートは、二重らせんスペーサーのセットを使用してこの角度にしっかりと保持されました。三角形のプラットフォーム上を掃くときに障害物を乗り越えるためには、ローターアームを上方に曲げる必要があります。この曲げは、ボルツマン加重方式でローターを障害物の間に閉じ込めることができるエネルギー障壁を構成します。モーターには、ビオチン部分や蛍光色素などの機能修飾も含まれており（図1f）、個々のモーター粒子の動きの実験的観察が可能になります。ビオチン部分を使用すると、ステーターごとにいくつかのビオチン - ニュートラアビジン結合を介してステーターを顕微鏡ガラスのカバーガラスにしっかりと取り付けることができ、回転アームの先端にある複数の蛍光色素により、個別のアームの位置に対する重心追跡 32 を使用して方向を決定できます。ラベル付きの三角形のプラットフォーム（図1f）。

a、b、それぞれ台座と三角プラットフォームの概略図。円柱は DNA 二重らせんを示します。 c、モーターの組み立て手順の概略図。 d、e、ローターアームコンポーネント。 f、左、倒立TIRF顕微鏡でモーターのダイナミクスを観察するための実験セットアップの概略図。台座は、いくつかのビオチン - ニュートラアビジン結合を介して顕微鏡のカバーガラスに固定されています。オレンジスター、Cy5 色素。青い星、DNA-PAINT イメージャー鎖の標識位置。右側、2 つのプラチナ電極が上から液体チャンバーに浸され、方形波交流を生成するファンクションジェネレーターに接続され、すべてのモーターに作用する固定軸のエネルギー変調が生成されます。

熱平衡では、システムが長時間の制限内で偏ることがないように、どの方向への運動も反対の運動によって相殺されます。そうでなければ、永久携帯電話が存在することになります。したがって、当社のモーターは、熱平衡から外れた状態でもラチェットとして動作するように設計されています。非対称またはバイアスされたラチェット効果を引き出すには、液体チャンバーに浸された電極を使用して非回転の交流（AC）場を適用します（図1f、拡張データ図1も参照）。この場により、サンプルチャンバー内を固定軸に沿って流れる交流イオン電流が発生します。この外部変調によって生成される時間平均された正味の力はゼロです。外部変調によって提供される、モーターの回転を決定する情報はありません。その代わりに、電界の軸に対するモーター内のエネルギー最小値の性質と位置に応じて、変調により磁界サイクルごとに運動学的非対称性が生じ、モーターが望ましい回転方向で移動する可能性があります (拡張データ図 2)。）。

我々はモーター設計を DNA 配列 29 (補足データセット 1 ～ 5) でエンコードし、前述の手順 33 を使用してワンポット反応混合物中でモーターを自己組織化しました。私たちは、ゲル電気泳動移動度解析 (拡張データ図 3) を使用して自己集合の品質を評価し、台座、三角プラットフォーム、ロータードックを含むモーター複合体の 3D 形状を 3D 電子密度マップで検証しました。単粒子クライオ電子顕微鏡法（クライオEM）を使用して決定しました（図2a、bおよび拡張データ図4）。電子密度マップは、障害物やロータードックなど、必要な主な構造的特徴をすべて解像度内で示しました。また、全長ローターアームを備えた完全なモーター複合体の正しい組み立てを、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（TEM）によるイメージングによって検証しました（図2c）。

a, 単一粒子クライオ EM によって測定されたモーターブロックの 3D 電子密度マップのさまざまなビュー (拡張データ図 4 およびコード EMD-14358 の電子顕微鏡データバンク (EMDB) も参照)。 b. モーターブロックのクライオ EM マップの詳細。3 つの障害物とロータードックを識別できるさまざまな密度しきい値で表示されます。挿入図は、ローターアームの 6 つの推奨配置場所を示す概略図です。 c、長いローターアームが取り付けられたモーターの変形例のネガティブ染色TEM画像の例。スケールバー、50 nm。 d、例示的な単一粒子蛍光画像。スケールバー、500 nm。画像は、記録された TIRF ビデオからすべてのフレームにわたって計算されたピクセルあたりの平均強度の標準偏差を示しています。 e、三角形のプラットフォームに対するローターアーム先端の位置を示す DNA-PAINT 画像。スケールバー、500 nm。

平衡状態にある表面固定化モーター粒子の全反射蛍光（TIRF）顕微鏡検査では、ローターアームが6つの個別の位置に優先的に留まる回転粒子が示されました（図2dおよび拡張データ図5aおよび6）。これらの位置は、DNA-PAINT イメージング 34 を使用して確立した、突き出た障害物の両側にローターアームが捕らえられた方向に対応していました (図 2e および拡張データ図 5b)。 DNA-PAINT 画像は、三角形のプラットフォームとはるかに長いローターアームの相対的な寸法を説得力のある図で示しています。したがって、私たちのモーター複合体は、いくつかのエネルギー最小値を特徴とする拡散回転機構を実現します（拡張データ図7）。

重心トラッキング 32 を使用して、単一粒子 TIRF ビデオからフレームごとのローターアームの向きをより正確に決定しました。平衡状態では、つまり外部磁場がオフの場合、モーター粒子は、エネルギーランドスケープにおける平衡変動から予想されるように、累積角変位が消失する不偏のランダムな回転運動を示しました（図3aおよび拡張データ図8）。対照的に、AC磁場をオンにすると、モーター粒子の一部（32.3％）が、ランダムな無向回転から、方向性のあるバイアスのある連続回転に即座に変化しました（図3aおよび補足ビデオ1および2）。私たちが記録した最大角速度は毎分約 250 回転で、フィールドがオンになったとき、ほぼ同数のモーターが時計回り (CW) と反時計回り (CCW) 方向に連続的に回転しました (図 3b)。

a、最初の 10 秒間 AC 磁場をオフにした場合の、ローターアーム先端の累積角変位を示す例示的な単一粒子トレース。青とオレンジ、それぞれ時計回りと反時計回りに回転するモーターの例。緑色は、フィールドがオンになっているときでも明らかな偏りなく小刻みに動き続けるパーティクルです。特に指定しない限り、AC 磁界は振幅 20 V の 5 Hz の方形波でした。 AC 磁場をオフにした最初の 10 秒の拡大図は、拡張データ図 8 にあります。 b、磁場をオフにした場合の単一粒子の角速度のヒストグラム (左、N = 557) と磁場をオンにした場合 (右、右、N = 557) N = 1,078)。 c. モーター速度に対する AC 磁界の軸方向の影響を示す例示的な単一モータートレース。 AC フィールド軸は 5° ずつ段階的に回転されました。破線は、磁場の方向が更新された時点を示します。 d、さまざまなAC磁界軸の位相補正された角速度の散布図（N = 75）。箱ひげ図は 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示し、ひげは 10 パーセンタイルと 90 パーセンタイルを示します。ボックス内の赤い線は中央値を示します。 e、実線は、AC周波数掃引中に見られる例示的な単一粒子トレースであり、CCWおよびCW回転モーターを示しています。点線は、ターン/フィールドサイクルとしての実効角速度を示します。 f、実線。電圧掃引中に見られる例示的な単一粒子トレース。CCW および CW 回転モーターを示します。点線は e のような方向性バイアス効率を示します。 g、さまざまな周波数（左、N = 156）およびさまざまな電圧（右、N = 28）の AC 磁場サイクルごとの絶対角速度の散布図。 dのような箱ひげ図。補足ビデオ 1 ～ 8 も参照してください。

ソースデータ

各モーター粒子の回転方向と有効角速度は、モーター粒子 (基板上に固定されている) に対する AC 磁界軸の向きによって制御できます。この特性を実証するために、カバーガラス面の x 方向と y 方向に印加される電場の重ね合わせによって AC 磁場軸の有効方向を調整できる 4 電極セットアップを使用しました。 1 セットの実験では、単一モーターの動きを記録および追跡しながら、AC 磁界軸を 1.6 秒ごとに 5° ずつ回転させました。その結果、時間の関数として単一粒子あたりの累積角変位を与える単一粒子の軌道が得られました（図3cおよび補足ビデオ3および4）。これらのデータから、各モーターの実効角速度を計算し、1.6 秒ごとの界磁軸の向きの関数としてプロットしました (拡張データ図 9)。ほとんどのモーターでは、失速や方向反転を含め、界磁方向に対するモーター速度の正弦波依存性が観察されます。各モーターには、モーターが最大速度と最小速度を示す特定の AC 磁界の向きがあります。モーター速度間のこれらの「位相シフト」は、モーターが顕微鏡カバースリップ上でランダムな向きで固定されているという事実によるものであると考えられます。角速度と磁界方向のデータを調整し、75 個のモーター粒子のアンサンブルにわたる角速度の平均と標準偏差を計算しました。これにより、モーター間の速度変動の印象が得られます (図 3d)。また、個々のモーターのダイナミクスを交流磁場の周波数と振幅の関数として特徴付けました（図3e〜gおよび補足ビデオ5〜8）。モーターの実効角速度は AC 周波数に依存し、最適な駆動周波数は 5 Hz でした。回転の方向性バイアスは、DC 磁場を印加した場合には存在せず、高い AC 周波数 (100 Hz) でも消滅しました。同様に、モーターの角速度も AC 磁界の振幅によって制御でき、20 ～ 60 V の振幅帯域で最適な有効角速度が示されます。

記録されたデータに基づいて、モーターが環境に及ぼすトルクと仕事を推定できます。図 3 の実験では、溶媒と長いローターアームの摩擦抵抗の形で消散しました。。ローターアームの回転摩擦係数 \(({\zeta }_{{\rm{r}}}=\pi \eta {L}^{3})\) は約 4 × 10−22 N・m・s です。。観測された最大角速度 25 ラジアン s-1 (1,500° s-1) に基づいて、最大トルクは約 10 pN nm に達します。これは、F1F0-ATPase が生成できる 50 pN nm と比較できます 35。。摩擦により消費されるモーターの推定最大出力は 250 pN nm s-1 (62 kBT s-1) で、これは細胞条件で 1 秒あたり約 2.5 個の ATP 分子の加水分解によってもたらされる自由エネルギーに相当します。

図 4a ～図 4c の有効エネルギーの状況を考慮することで、モーターのメカニズムについての洞察を得ることができます。これは、単純化された 2 極小回転モーターのさまざまな固定子界磁方向に対して例示的に計算されています (拡張データ図 2 も参照)。正味の方向性の選択 (バイアスまたはラチェット) に必要な非対称性は、モーター本体によって提供される背景の静的電位ランドスケープと外部変調場との間の相互作用によって作成されます。非対称性の程度は、磁場に対するモーターエネルギーランドスの向きに依存します（図4c）。これらのエネルギーランドスケープにおけるランジュバンダイナミクスシミュレーションによって例示的に示されているように、それぞれCW、CCW、方向バイアスのない回転軌道が得られます。。実験ではモーター粒子を顕微鏡カバースライド上にランダムに堆積させたので、磁界軸に対するモーターの向きのほぼ均一なサンプリング、つまりさまざまな速度で時計回りまたは反時計回りに回転するモーターのサンプリングが得られました（図3c、d）。補足ビデオ 9 ～ 11 は、予想されるモーター速度が磁界の向き、周波数、振幅にどのように依存するかを概略的にまとめています。

a、実線、単純化された 2 つの最小値を持つモーターの内部エネルギーの概略図。破線と点線は、0°～180° 軸に沿って印加された外部 AC 場のエネルギー的寄与。挿入図、極座標でのエネルギー関数。 b、実線、内部モーターエネルギーと場の寄与の合計のスナップショット。破線、磁界方向反転時のローターアームの予想軌道。フィールド半サイクルごとの初期位置はドットで示されます。 c、aおよびbからの仮想の2最小モーターのエネルギーランドスケープは、2D時空面としてプロットされ、界軸に対するモーターの3つの例示的な向きについて計算されます（挿入図を参照）。フィールド軸は 0° ～ 180° 方向に沿っています。黄色の点は、ランジュバン力学によってシミュレートされた例示的な単一粒子の軌道です。 d、シミュレートされたランジュバン力学軌道から集計された、2、4、および6回の交流磁場サイクル後の累積角変位の分布。 180 度間隔の顕著なピークは、シミュレートされたエネルギーランドスケープにおける二重対称性によるものです。 e、シミュレートされたモーターの不可逆性解析。異なる変位値および 2、4、6 AC サイクルの時間間隔で評価された 20 個のシミュレートされたモーターのアンサンブル平均が色で示されています。パネル a に示すように、モーターには二重対称が含まれています。青のスキームではフィールドに対して 45° のモーターの向きが使用され、赤のスキームでは対称の向き (0°) が使用されます。実線、トレンドまたはその欠如を強調するための目のガイド。 f、実験的に観察されたモーター粒子の不可逆性解析。パネル d のように、分布の色分けは時間間隔を示します。回転速度の変動を考慮するため、各ローターの線形傾向は、示されている分布を計算する前に単一の傾きに再正規化されました。視線を誘導するために、単位勾配の線が追加されました。実験的に観察された粒子の不可逆性解析については、拡張データ図 10b を参照してください。 g、左、ピボット点に ssDNA ねじりバネを含むモーターの変形例の概略図。右は、実験的に観察された単一モーター粒子の累積角変位の例です。第 1 段階: AC フィールドがオフになり、スプリングが緩みます。第 2 段階: AC フィールドがオンになり、スプリングが巻き上げられます。第 3 段階: AC フィールドがオフになり、スプリングが巻き戻され、動作が駆動されます。補足ビデオ 12 および 13 も参照してください。

ソースデータ

個々のモーターのレベルでメカニズムの不可逆性をテストするために、確率的熱力学の文脈でその変動の特性を分析しました36。変位角の分布を時間の関数として（交流磁場周期 T の倍数で）コンパイルすると、回転子はバイアスの方向に沿って、またそれに逆らって自然に確率的ステップを取ることが期待されます（図 4d を参照）。図3aも参照）。確率熱力学を使用すると、上流と下流の遷移速度の比から、有限の軌道を持つ非平衡系におけるエントロピー生成の程度を調べることができます。 \({\rm{P}}\left({\theta }_{0}+\Delta \theta ,t| {\theta }_{0,}0\right)\) を回転の確率として次のように表します。 θ0 の初期位置から期間 t にわたって角度 Δθ を測定すると、時間 t = nT (AC 磁界の周期の整数倍) にわたるナノモーターの平均エントロピー生成 Δs を抽出することによって、不可逆性を探る変動関係が期待されます。 )、形式で

ここで、ωeff と Deff は、確率的ラチェット運動全体にわたるナノモーターの実効角速度と拡散係数をそれぞれ表します。実効拡散係数は実効摩擦係数 zeff に関係しており、これは非平衡駆動の微視的なメカニズムに依存します。式 (1) は時間 t = nT とは無関係であることに注意してください。この関係は、私たちが実行したシミュレーション（図4e）にも当てはまります。また、すべてのプロットが非直線で傾き統一の線に崩れていることからわかるように、連続回転モーターの実験データにも当てはまります（図4f）。 - 傾きの再スケーリングによる平衡ケース。非平衡駆動は、拡散挙動から弾道挙動へのクロスオーバーを示す平均二乗変位でも調べることができます (拡張データ図 10a)。モーターの効率の大まかな理論的推定値を提示できます。システムが外部トルク τ に対して動作するとき、その正味角速度は \({\omega }_{{\rm{eff}}}\left(\tau \right)={\omega }_{{\rm {eff}}}-\tau /{\zeta }_{{\rm{r}}}\)、ここから単位時間当たりの有効仕事量 \({\omega }_{{\rm{eff}}) }\left(\tau \right)\times \tau =({\omega }_{{\rm{eff}}}-\tau /{\zeta }_{r})\times \tau \) は次のようになります。公称効率推定値 \(\epsilon \equiv \frac{({\omega }_{{\rm{eff}}}-\tau /{\zeta }_{{\rm{r}}}) で抽出されます。 )\times \tau \,}{{{\rm{\zeta }}}_{{\rm{eff}}}{\times {\rm{\omega }}}_{{\rm{eff}} }^{2}}\) 。したがって、\(\tau ={\zeta }_{{\rm{r}}}{\omega }_{{\rm{eff}}}/2\) のときに最大の仕事を抽出でき、 \(\epsilon \le \frac{{\zeta }_{{\rm{r}}}\,}{{4{\rm{\zeta }}}_{{\rm{エフ}}}}\)。

また、モーターがさらなる負荷に対してトルクを生成できるかどうかもテストしました。この目的を達成するために、ピボット点にねじりバネを含むモーターの変形例を設計しました（図4g、拡張データ図11、および補足図4）。ねじりバネは、一端が台座に固定され、もう一端がローターアームに固定された一本鎖 DNA ループで構成されていました。ローターの回転により、ローターピボット接続の周りにエントロピースプリングとしてループが巻き付けられます。巻線は復元力を生成し、巻き上げられたスプリングによって生成されるトルクがモーターによって供給される最大トルクと釣り合うと、最終的にモーターを失速させます。このように張られたスプリングは、外部エネルギー供給が遮断されたときに、スプリングが再び緩むまでローターを反対方向に駆動できるエネルギー貯蔵庫として機能します。この予測された挙動は、私たちが観察したものと一致しています。ねじりバネを特徴とする個々の粒子は、交流磁場がオンになっているときは失速するまで前進回転を示し、交流場が遮断されるとすぐに反対方向に前進回転を始めました（図4gと図4g）。補足ビデオ 12 および 13)。

結論として、当社の高分子回転モーターは、溶液中の粘性抵抗に抗して持続的に回転することと、分子ねじりバネを巻き上げる能力によって証明されるように、仕事を実行できます。毎分最大 250 回転の角速度と最大 10 pN nm のトルクを備えたモーターは、ATP シンターゼなどの強力な天然分子機械で知られている回転速度とトルクに近い回転速度とトルクを実現します。モーターは、モーターを制御するためにユーザーが提供するフィードバックや情報を必要としない、単純な外部エネルギー変調によって駆動される固有の機械特性により方向性を持って動きます。当社のモーターには、マクロスケールモーターでよく知られている制御オプションも用意されています。ユーザーは自由にモーターのオンとオフを切り替えることができ、素早く反応し、回転速度と方向を調整できます。モーターは、標準的なウェットラボ装置を利用できる人であれば誰でも製造および操作できます。他のユーザーが、たとえば商業ソースから入手した DNA 分子を使用して独自のモーターを複製および構築できるようにするには、配列情報を送信するだけで十分です。必要な DNA 分子の生産は、大量にスケールすることができます 37。 DNA 折り紙コンポーネントのモジュール性により、モーターも変更、適応、他のコンテキストに統合できることが期待されます。ゴピナスら。彼らは最近、プログラム可能な方法でパターン化された固体表面上に DNA 折り紙オブジェクトを配置および方向付ける方法を説明しました 38,39。これらの方法を使用すると、界磁軸に対する固定子の向きが制御されたモーターのアレイを構築し、同期回転を実現できます40。私たちのモーター設計と動作コンセプトは、DNA origami 以外の他のシステムにも適用できる可能性があります。たとえば、荷電した残留物を特徴とするタンパク質ベースの回転アセンブリは、おそらく新たに設計され、交流磁場による方向性バイアスで回転駆動される可能性があります。さらに、電場の代わりに、交互の流体の流れなど、方向性が交互になる他のエネルギー供給も同様に使用できると考えられます。自然な次のフロンティアは、化学反応を通じてバリア調節を引き起こすことを探求し、方向性のあるモーター運動を利用して、調整された往復運動を特徴とするより精巧な合成メカニズムを使用して上り坂の化学合成を推進することだろう。F1F0-ATP シンターゼが機械的に ATP を合成するのとよく似ている。回転運動。

すべての構造は cadnano 0.2 を使用して設計されました (参考文献 41)。台座は 7,585 塩基長の線形化カスタム足場から折り畳まれましたが、ねじりバネを備えた台座は 8,064 塩基長の足場と両方のローターアーム部分から折り畳まれました。三角形のプラットフォームは、9,072 塩基の長さの足場から折り畳まれました 42。

8,064 塩基の長さの円形足場は、前述したように 43 、2 L 撹拌バイオリアクターから調製されました。長さ 9,072 塩基の円形足場、および長さ 7,585 塩基の線状足場の円形前駆体は、前述のように振盪フラスコ培養から調製されました 42。足場を線状にするために、前述のように亜鉛を消化しました37。

すべてのフォールディング反応混合物には、最終足場濃度 50 nM、および各 500 nM (三角プラットフォームの場合) または各 200 nM (他の構造の場合) のオリゴヌクレオチド鎖 (Integrated DNA Technologies (IDT)) が含まれていました。フォールディング反応バッファーには、5 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 (TRIS-HCl)、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、5 mM NaCl、および 10 mM (ローターアーム)、15 mM (両方のペデスタルバリアント)、または 20 mM (三角アーム) が含まれていました。プラットフォーム) MgCl2。折り畳み溶液は、Tetrad (MJ Research、現在は Bio-Rad) 熱サイクル装置を使用して熱アニールされました。反応物を 65 °C で 15 分間放置し、その後 60 °C から 44 °C までの熱アニーリングランプ (1 °C h-1) にさらしました。折り畳まれた構造は、さらなるサンプル調製ステップまで室温で保管されました。すべての DNA 配列は補足データ表 1 ～ 5 で入手できます。

すべての折りたたまれた構造は、ポリエチレングリコール (PEG) 沈殿 (ローターアームおよびペデスタルバリアント) またはアガロースゲルからの物理的抽出 (三角プラットフォーム) のいずれかによって、過剰なオリゴヌクレオチドから精製されました。ゲル精製したモノマーを超遠心分離を使用して濃縮しました。 PEG 精製したローターアーム拡張部を、10 mM の MgCl2 濃度で 1 時間、30 °C で接続するオリゴヌクレオチド鎖のセットとともにさらにインキュベートし、その後、PEG を再度沈殿させました。すべての手順は前述のように実行されました 33。

最初のステップとして、2 つのダイマー、三角形のプラットフォームとペデスタル (ダイマー 1)、および 2 つのローターアーム部分 (ダイマー 2) を、それぞれのモノマーの 1:1 溶液を MgCl2 の最終濃度で混合することによって組み立てました。 40 mM (ダイマー 1) および 5 mM (ダイマー 2)、40 °C で少なくとも 16 時間放置。次いで、二量体１をＰＥＧ沈殿させて、緩衝液を最終ＭｇＣｌ２濃度５ｍＭに交換した。両方の二量体を混合し、10 mM MgCl2 で最低 16 時間インキュベートしました。

折りたたまれて組み立てられた DNA ナノ構造を、水冷ゲルボックス内で、0.5 × トリス-ホウ酸-EDTA および 5.5 mM MgCl2 を含む 1.5% または 2% アガロースゲル上で、90 または 100 V のバイアス電圧で 1.5 ～ 3 時間電気泳動しました。電気泳動したアガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、Typhoon FLA 9500 レーザースキャナー (GE Healthcare) を使用してピクセルあたり 50 μm の解像度でスキャンしました。

5 μl の量のサンプルをカーボン担体を備えたグロー放電 Cu グリッド (社内製造およびサイエンスサービス、ミュンヘン) に吸着させ、25 mM NaOH を含む 2% ギ酸ウラニル水溶液で染色しました。サンプルは、濃度に応じて異なる時間インキュベートされました。一般に、数十 nM 程度の濃度の構造は 30 秒間インキュベートされましたが、より低濃度のサンプル (5 nM 以下) は 5 ～ 10 分間インキュベートされました。画像は、100 kVで動作するPhilips CM100顕微鏡を使用して取得されました。

精製および濃縮されたサンプルをグロー放電 C-Flat 2/1-4C (EMS) グリッド (Protochips) に適用し、Vitrobot Mark V (FEI、現在は Thermo Scientific) を使用して次の設定でプランジ凍結しました: 温度 22° ℃、湿度９０％、待機時間０秒、ブロット時間３秒、ブロット力−１、ドレイン時間０秒。

データは、EPU ソフトウェア (Thermo Scientific) を使用して、Falcon 3 直接検出器を備えた 300 kV で動作する Titan Krios G2 電子顕微鏡で取得されました。 11 回に分けて 44 e オングストローム -2 の線量で合計 3.3 秒の露光を使用しました。

画像処理は RELION 3.0 で実行されました (参考文献 44、45)。顕微鏡写真は、それぞれ MotionCor2 (参考文献 46) と CTFFIND4.1 (参考文献 47) を使用して動き補正され、コントラスト伝達関数が推定されました。 crYOLO48 を使用して粒子を選択しました。自動選択された粒子は顕微鏡写真から抽出され、2 つずつビンに分けられ、1 回の 2D および 3D 分類を受けて、誤って選択されたグリッドの汚染や損傷した粒子を除去し、構造的不均一性に対処しました。 RELION で作成された低解像度の初期モデルを使用して、洗練された 3D マップが再構築されました。最終的な再構成には、合計 38,649 個の粒子が使用されました。マップは、ローパスフィルター処理されたマスクを使用して後処理され、フーリエシェル相関が計算され、手動で設定された B ファクター -500 で 16 オングストロームのグローバル解像度が推定されました。

モノマーは、前述のように折りたたまれ、精製され、組み立てられました。ビオチン化オリゴを 32 倍過剰のニュートラアビジン (Thermo Fisher Scientific) とインキュベートし、結合部位に約 10 倍過剰でポリマーに室温で 1 ～ 2 時間添加しました。得られた反応混合物を、四量体種のみを抽出することによってゲル精製した。サンプル濃度は約 100 pM でした。必要に応じて、三角形のプラットフォーム上に障害物を取り付けるために、2 つのスペーサーオリゴヌクレオチド鎖のセットを約 100 倍過剰にサンプルに追加しました。すべてのサンプルは、顕微鏡で画像化するまで最大数週間室温で保管されました。

ビオチン - PEG カバーガラススライドの準備、フローチャンバーの製造、および TIRF 顕微鏡のセットアップは、参考文献で以前に説明されているとおりです。 25. サンプルを、500 mM NaCl、100 mM TRIS-HCl、および 2 mM EDTA を含むイメージングバッファー (FMB 500) で 100 pM 未満に希釈し、サンプルチャンバーに添加し、ビオチン - ストレプトアビジン - ビオチンを介してガラス表面に固定化しました。リンケージ。約5分後にFMB 500でフラッシュすることにより、結合していない構造を除去した。次に、サンプルチャンバーを、150 mM TRIS-HCl、1 mM EDTA、1.5 M NaCl を含み、2 mM Trolox (6-ヒドロキシ-2,5,7) を含む酸素除去システムを含む最終イメージングバッファー (FMB 1.5) で 2 回フラッシュしました。、8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸）、0.8% D-グルコース、2,000 U ml-1 カタラーゼおよび 165 U ml-1 グルコースオキシダーゼ。ねじりバネの測定では、30% のスクロースを追加し、最終的な NaCl 濃度を 1 M に下げました。酵素、Trolox およびグルコースは Sigma-Aldrich から購入しました。最後に、サンプルチャンバーを FMB 1.5 で完全に満たし、動作電圧が印加される厚さ 0.2 mm の白金ワイヤーを固定するカスタムメイドのプラグをフローチャンバーの上部に取り付けました。印加電圧は、最終出力電圧を生成するためにカスタムビルドのオペアンプに制御電圧を供給するカスタムビルドの LabVIEW ルーチンによって制御されました。ビデオは、0 ～ 60 V の単軸 AC 磁場および 1 ～ 100 Hz の周波数を印加して、250 フレーム s-1 のフレームレートで 40 ～ 64 秒間取得されました。

移動する粒子は手動で位置特定され、ピカソソフトウェア 49 を使用してガウスフィッティングおよび選択が行われました。後続のすべてのステップは、カスタム MATLAB スクリプトを使用して実行されました。ローターアーム先端の位置の追跡から、累積角変位が得られました。さらに、角速度 (Ω) は次のように計算されました。

ここで、θ はそれぞれのフレーム (外部 AC 磁界の有無にかかわらず、期間の最初と最後のフレーム) での角度であり、Δt はこれら 2 つのフレーム間の時間差を示します。角速度のヒストグラムを計算した。

DNA-PAINT 超解像度イメージングでは、三角形のプラットフォームの 3 つの角すべてが 3 つの一時的な DNA-PAINT 結合部位で標識されました。ローター拡散データを取得した後、酸素除去システムを含む FMB 1.5 イメージングバッファーを、1 × TAE、12 mM MgCl2、0.05% TWEEN20 および 20 nM P1 イメージャー鎖からなる DNA-PAINT イメージングソリューションと交換しました。 DNA-PAINT データを取得する前に、ローター蛍光団は 642 nm 励起への曝露を増やすことによって漂白されました。ビデオは、400 ミリ秒の露光と 70 mW の 642 nm 励起レーザー出力で 7,000 フレーム記録されました。イメージャ結合イベントのスポット検出および点広がり関数のガウスフィッティングは、Picasso ソフトウェアパッケージの「Localize」機能を使用して実行されました。続いて、「レンダリング」機能を使用して結果のイベントリストを視覚化し、DNA-PAINT の超解像度データをローター拡散測定のデータと関連付けました。

シミュレーションでは、ローターアームを時間依存の 1D エネルギーランドスケープ U(ϑ, t) 内のブラウン粒子として見ます。これにより、一次方程式を書くことができます。

\(\left\langle \eta \left(t\right)\eta \left({t}^{{\prime} }\right)\right\rangle =\) を満たす減衰定数 λ とノイズ項 η を持つ\(2{k}_{{\rm{B}}}T\lambda \delta \left(t-{t}^{{\prime} }\right)\)。エネルギーランドスケープは、時間に依存しないローター固有の寄与と、交流する外部電場で構成されます。

その中で

は、振動周期 T の交流外部電場を表します。パラメータ a、b、c は、それぞれ、電場の相対的な強度、固有の回転子のランドスケープ、および局所エネルギー最小値の幅を示します。さらに、θ0 は回転子と界磁軸との間の角度を表し、エネルギー最小値は Δθ だけ離れて配置されます。回転力学へのリンクを確実にするには、Δθ が 2π の単純な分数でなければなりません。数値安定性を高めるために、微分可能なエネルギーランドスケープを使用して、いくつかの大きな N を近似します。

本文で説明され、図 4 に示されている不可逆性解析は、次の方法でデータに対して実行されます。時間間隔 Δt が与えられると、すべてのペア \(\triangle {{\vartheta }}_{t}={{\vartheta }}_{n+t}-{{\vartheta }}_{n}\) を計算します。時系列 {ϑn} から。この ϑn は、前の全回転を含むローターの角度位置を測定します。

これらのデータから、確率分布 \(p\left({{\vartheta }}_{0}\) のガウスカーネル (https://github.com/JuliaStats/KernelDensity.jl) によるカーネル密度推定を使用します。 {\rm{mod}}\,360,\triangle {\vartheta }\right)\)、位置 ϑ0 から ϑ0 + Δϑ へのジャンプを表します。この分布を使用して、次のように計算します。

初期位置 \({{\vartheta }}_{0}\in [0,360)\) を平均することによって。各ローター k を解析すると、近似的に次の関数 \({\left(\frac{\triangle s}{{k}_{{\rm{B}}}}\right)}_{k}\) が得られます。 t に依存しない線形傾向。これらの関数の推定分布を、シミュレートされたローターと実験ローターについて図 4 に示します。結果として得られるトレンドの平均傾きは回転バイアスに比例します。さまざまな実験用モーターの回転バイアスの顕著な変動を考慮して、すべての傾向を単位の傾きに再正規化しました。この繰り込みステップは、除外されたバイアスのない実験モーターでは不明確になります。

図 2 に示すクライオ EM マップは、電子顕微鏡データバンク (EMDB) でアクセッションコード EMD-14358 として入手できます。 Cryo-EM およびリアルタイム蛍光ビデオの生データは、ご要望に応じて担当著者から入手できます。オリゴとスキャフォールドの配列、およびソースデータは補足情報ファイルで入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

TIRF 顕微鏡データ解析用の MATLAB スクリプトは、https://github.com/DietzlabTUM/matlab_tirfm_movies50 からダウンロードできます。

Astumian、RD ブラウンモーターの熱力学と動力学。サイエンス 276、917–922 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Reimann、P. Brownian モーター: 平衡状態から遠く離れた騒々しい輸送。物理学。議員 361、57–265 (2001)。

記事 ADS MathSciNet MATH Google Scholar

Rousselet, J.、Salome, L.、Ajdari, A. & Prost, J. 周期的な非対称ポテンシャルによって引き起こされるブラウン粒子の方向運動。ネイチャー 370、446–448 (1994)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Astumian、RD & Hänggi、P. Brownian モーター。物理学。今日 55、33–39 (2002)。

記事 Google Scholar

Hänggi, P. & Marchesoni, F. 人工ブラウンモーター: ナノスケールで輸送を制御。 Rev.Mod. 物理学。 81、387 (2009)。

記事 ADS Google Scholar

Boyer PD ATP シンターゼは素晴らしい分子機械です。アンヌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 66、717–749 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pinke, G.、Zhou, L.、Sazanov, LA 哺乳類 F 型 ATP シンターゼ全体の Cryo-EM 構造。ナット。構造体。モル。バイオル。 27、1077–1085 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Noji, H.、Yasuda, R.、Yoda, M. & Kinosita, K. Jr. F1-ATPase の回転の直接観察。 Nature 386, 299–302 (1997)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Koumura, N.、Zijlstra, RW、van Delden, RA、Harada, N. & Feringa, BL 光駆動の一方向分子ローター。 Nature 401、152–155 (1999)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Kistemaker、JCM 他第 3 世代の光駆動対称分子モーター。混雑する。化学。社会 139、9650–9661 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィルソン、MR 他。自律的な化学燃料の小分子モーター。ネイチャー 534、235–240 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Hernandez、JV、Kay、ER、Leigh、DA 可逆合成回転分子モーター。サイエンス 306、1532–1537 (2004)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

ノースカロライナ州シーマン DNA に基づくナノマテリアル。アンヌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 79、65–87 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramezani, H. & Dietz, H. DNA 分子を使った機械の構築。ナット。ジュネ牧師。 21、5–26 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Marras, AE、Zhou, L.、Su, HJ & Castro, CE DNA 折り紙メカニズムのプログラム可能な動作。手順国立アカデミー。科学。 USA 112、713–718 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ketterer, P.、Willner, EM & Dietz, H. ぴったりとフィットする 3D DNA コンポーネントから形成されたナノスケール回転装置。科学。上級 2、e1501209 (2016)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

List, J.、Falgenhauer, E.、Kopperger, E.、Pardatscher, G. & Simmel, FC 機械的に連結された大きな DNA ナノ構造の長距離移動。ナット。共通。 7、12414 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, DY & Winfree, E. トーホールド交換を使用した DNA 鎖変位速度の制御。混雑する。化学。社会 131、17303–17314 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yurke, B.、Turberfield, AJ、Mills, AP Jr.、Simmel, FC & Neumann, JL DNA で作られた DNA 燃料の分子機械。ネイチャー 406、605–608 (2000)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Gerling, T.、Wagenbauer, KF、Neuner, AM & Dietz, H. 形状相補的な非塩基対形成 3D コンポーネントによって形成される動的 DNA デバイスおよびアセンブリ。サイエンス 347、1446–1452 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Ijas, H.、Hakaste, I.、Shen, B.、Kostiainen, MA & Linko, V. pH 制御されたカプセル化とカーゴの表示のための再構成可能な DNA 折り紙ナノカプセル。 ACS Nano 13、5959–5967 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Idili, A. & Ricci, F.、DNA Nanotechnology Vol. 1811 (Zuccheri, G.編) 79–100 (Humana Press、2018)。

Majikes, JM、Ferraz, LCC & LaBean, TH 溶液中および表面上の平行な I モチーフ配列を介した DNA 折り紙の pH 駆動による作動。バイオコンジュグ。化学。 28、1821–1825 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

バージニア州トゥレックら。 DNA 折り紙屈筋の熱応答性作動。上級機能。メーター。 28、1706410 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Kopperger, E. et al. 電場によって制御される自己組み立て型のナノスケールロボットアーム。サイエンス 359、296–301 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Kosuri, P.、Altheimer, BD、Dai, M.、ying, P. & Zhuang, X. DNA 折り紙ローターを使用したゲノム処理酵素の回転追跡。ネイチャー 572、136–140 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゴレスタニアン、R。合成メカノケミカル分子スイマー。物理学。レット牧師。 105、018103 (2010)。

論文 ADS PubMed CAS Google Scholar

ゴレスタニアン、R. & アジュダリ、A. 確率的低レイノルズ数の水泳選手。Ｊ．Ｐｈｙｓ．凝縮します。事項 21、204104 (2009)。

論文 ADS PubMed CAS Google Scholar

ダグラス、SM et al. DNA をナノスケールの 3 次元形状に自己集合させます。ネイチャー 459、414–418 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rothemund、PW ナノスケールの形状とパターンを作成するための DNA の折りたたみ。 Nature 440、297–302 (2006)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

キルヒヘル、F. et al. DNA における積層力の単一分子の分析。サイエンス 353、aaf5508 (2016)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

ユルディス、A.、富重、M.、ヴェイル、RD、セルビン、PR キネシンが手をつないで歩きます。サイエンス 303、676–678 (2004)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ワーゲンバウアー、KF 他。 DNA折り紙の作り方。 ChemBioChem 18、1873–1885 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jungmann、R.ら。 DNA 折り紙上の一時的な結合の蛍光イメージングによる単一分子の反応速度論と超解像度顕微鏡。ナノレット。 10、4756–4761 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Pänke, O.、Cherepanov, DA、Gumbiowski, K.、Engelbrecht, S. & Junge, W. 回転 F-ATPase と結合したアクチンフィラメントの粘弾性ダイナミクス: 酵素の角トルクプロファイル。生物物理学。 J. 81、1220–1233 (2001)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Seifert、U. 確率的熱力学、変動定理、分子機械。プログレ議員。物理学。 75、126001 (2012)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

プレトリウス、F.ら。 DNA折り紙のバイオテクノロジーによる大量生産。ネイチャー 552、84–87 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Gopinath, A.、Miyazono, E.、Faraon, A. & Rothemund, PW DNA 折り紙の精密配置によるナノキャビティ発光のエンジニアリングとマッピング。ネイチャー 535、401–405 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Gopinath, A. & Rothemund, PW 単一分子 DNA 折り紙ナノアレイの最適化されたアセンブリと共有結合。 ACS Nano 8、12030–12040 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

松永大輔ほか磁気ローターの一括回転パターンを制御します。ナット。共通。 10、4696 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

ダグラス、SM et al. caDNAno を使用した 3D DNA 折り紙形状のラピッドプロトタイピング。核酸研究所 37、5001–5006 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エンゲルハルト、FAS et al. デザイン固有の足場を備えた、カスタムサイズ、機能的、耐久性のある DNA 折り紙。 ACS Nano 13、5015–5027 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kick, B.、Praetorius, F.、Dietz, H. & Weuster-Botz, D. DNA 折り紙の足場としての一本鎖ファージ DNA の効率的な生産。ナノレット。 15、4672–4676 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジバノフ、J.ら。 RELION-3 での自動高解像度クライオ EM 構造決定のための新しいツール。 Elife 7、e42166 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagane, T.、Kimanius, D.、Lindahl, E.、Scheres, SH RELION の多体精密化によるクライオ EM 単一粒子データの分子運動の特性評価。 Elife 7、e36861 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng、SQら。 MotionCor2: 改善されたクライオ電子顕微鏡のためのビーム誘起運動の異方性補正。ナット。方法 14、331–332 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: 電子顕微鏡写真からの高速かつ正確な焦点ぼけ推定。Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．バイオル。 192、216–221 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO は、クライオ EM 用の高速かつ正確な完全自動粒子ピッカーです。共通。バイオル。 2、218 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

オクラホマ州ウェイドら。 DNA-PAINT の点滅動力学を工学的に応用した 124 色の超解像度イメージング。ナノレット。 19、2641–2646 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schickinger、MRJ、Funke、JJ、Pumm、AK、Engelen、W.、Bertosin E. DietzlabTUM/matlab_tirfm_movies: matlab_tirfm_movies の最初のリリース (1.0.0)。 https://github.com/DietzlabTUM/matlab_tirfm_movies、https://doi.org/10.5281/zenodo.5568757 (2021)。

リファレンスをダウンロードする

この研究は、HD への欧州研究評議会コンソリデーター補助金 (補助金契約 724261)、ゴットフリートヴィルヘルムライプニッツプログラム (HD へ) 内で提供された補助金を通じたドイツ研究機関、SFB863 プロジェクト ID 111166240 TPA9 (HD へ) および TPA8 (HD へ) によって支援されました。 FCS)、SFB 1032 プロジェクト ID 201269156 TPA2 (FCS へ)、およびオランダ科学研究機構 (NWO、ルビコンプログラム、プロジェクト番号 019.182EN.037 WE へ)。この研究は、マックス・プランク・スクール・マター・トゥ・ライフ（RG、FCS、HD）およびMaxSynBioコンソーシアム（RG）からの支援を受けており、これらはドイツ連邦教育研究省（BMBF）とマックス・スクールが共同で資金提供している。プランク協会。私たちは、TUM イノベーションネットワーク RISE 助成金を通じた連邦政府および州の卓越性戦略による追加支援に感謝します。

ドイツ、ミュンヘン近郊のガルヒングにあるミュンヘン工科大学、物理学科およびミュンヘン生体医工学研究所、生体分子ナノテクノロジー学部長

アンナ=カタリーナ・プム、ワウター・エンゲレン、ヴィクトリヤ・コジナ、マッシモ・クベ、マクシミリアン・N・ホーネマン、エヴァ・ベルトシン、ヘンドリック・ディーツ

ドイツ、ミュンヘン近郊のガルヒングにあるミュンヘン工科大学物理学科、合成生物システム物理学教授

エンツォ・コッペルガー、マティアス・フォークト、マルティン・ランゲッカー、フリードリヒ・C・ジンメル

マックス・プランク動的自己組織研究所、ゲッティンゲン、ドイツ

ジョナス・アイセンシー & ラミン・ゴレスタニアン

ルドルフ・パイエルス理論物理学センター、オックスフォード大学、オックスフォード、英国

ラミン・ゴレスタニアン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

A.-KP は、VK の支援を受けてモーターのバリアントを合成し、研究を実施しました。私たちはモンテカルロシミュレーションによるモーターメカニズムの理解に貢献しました。 A.-KP と EK は DNA-PAINT 実験を実施しました。 EK、MV、および ML は、FCS の監督のもと、モーター測定に使用される AC 磁場制御を備えたカスタム TIRF 顕微鏡セットアップを提供および操作しました。 JI はランジュバンシミュレーションを実行し、研究の理論部分も設計した RG の監督のもと、変動関係に関連した実験データを分析しました。 MNH はカスタムの足場 DNA 鎖を準備しました。 MK と EB はクライオ EM 実験を実施しました。 HD は研究プロジェクトを考案、設計し、研究の実験部分を監督しました。 A.-KP、WE、JI、RG、HD が図を用意し、原稿を書きました。著者全員が原稿を編集しコメントしました。

ラミン・ゴレスタニアン、フリードリヒ・C・ジンメル、ヘンドリック・ディーツとの通信。

A.-KP、WE、EK、HD を発明者として記載した特許が提出されています。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれたヘンリー・ヘスと他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、プラグを挿入したサンプルチャンバーの断面図。 b、組み立てられたサンプルチャンバーの上面図と、結果として得られるチャネル形状と電極配線の概略図（黒色の主電極ペア、灰色の2番目のオプションペア）。 c. 使用中のサンプルチャンバーの上部コンポーネント (左) と 1 つ (中央) と 2 つ (右) の電極ペアの粘着テープの寸法。 d、一軸AC電場用の1つの電極対を備えた顕微鏡カバースリップに取り付けられたローターの概略上面図。 e、AC磁場軸を回転させる可能性のための2つの電極対を備えた顕微鏡カバースリップに取り付けられたローターの概略上面図。

a、c、e、実線。最小値 1 つ (a)、最小値 2 つ (c)、および最小値 6 つ (e) を特徴とする単純化されたモデルモーターの内部エネルギーの概略図。破線と点線は、0°～180° 軸に沿って印加された外部 AC 場のエネルギー寄与。右側の挿入図は、エネルギー関数を極座標で示しています。 b、d、f、実線、最小値が 1 つ (b)、2 つ (d)、および 6 つ (f) のモーターの有効エネルギー状況 (つまり、モーターの内部エネルギーと場の寄与の合計) のスナップショット。破線は、磁界方向が反転した場合のローターアームの予想される軌道を示しています。フィールド半サイクルごとの初期位置はドットで示されます。

5.5 mM MgCl2 を含む 1.5% アガロースゲルを 100 V の水浴上で 165 分間泳動し、以下のサンプルを電気泳動したレーザースキャン画像。L、1 kb ラダー。 1、三角形のプラットフォーム; 2、台座。 3、ローターアームの最初の部分。 4、ローターアームの第2部分（延長部分）。 5、三角形のプラットフォームと台座ダイマー。 6、ローターアームダイマー。 7、完全に組み立てられた四量体。 P、ポケット。 Tet、四量体。 Dim1、三角形のプラットフォームと台座の二量体。 Dim2、ローターアームのダイマー。

a、顕微鏡写真の例。スケールバー、50 nm。 b、代表的な 2D クラスの平均。 c、粒子の配向分布を表すヒストグラム。 d、フーリエシェル相関プロット。 e, 電子密度マップの 6 つの異なるビュー。

a、単一粒子のTIRFビデオからの蛍光強度の標準偏差。スケールバー、500 nm。画像は、記録された TIRF ビデオからすべてのフレームにわたって計算されたピクセルあたりの平均強度の標準偏差を示しています。 b、三角形のプラットフォーム (青) に対するローターアーム先端の位置 (オレンジ) を示す DNA-PAINT 画像。スケールバー、500 nm。

a〜c、図2に示す粒子からの最初の76個の個々のフレーム画像のモンタージュ（左（a）、中央（b）、および右（c）粒子）。緑色のボックス、ビデオ全体の平均強度。赤いボックス、ビデオ全体から計算されたピクセルあたりの平均強度の標準偏差。

左は、仮想ウィンドウ質量中心 (vwcm) アプローチを使用したローターアーム先端位置の散布図です。中央の自由エネルギーは、重心追跡 (赤) と半径方向のピクセル強度 (青) から計算されます。右は、すべてのフレームにわたって計算されたピクセルごとの平均強度の平均です。

最初の 10 秒間 AC 磁場をオフにした場合の、図 3a に示すローターアーム先端の累積角変位を示す例示的な単一粒子トレースの拡大図。色付きのトレースは図 3a と同じです。

AC 磁界軸は 1.6 秒ごとに 5° ずつ段階的に回転しました。破線は、磁場の方向が更新された時点を示します。

ソースデータ

a、実験的に観察およびシミュレートされたモーターの平均二乗角変位。実験データ (緑色の点) を、対称なランドスケープ (黄色) および偏ったランドスケープ (青色) で実行されたシミュレーションと比較します。不偏シミュレーションは、長時間にわたって拡散的に動作します。偏ったシミュレーションと実験データは両方とも、短時間では拡散的に動作しますが、長時間では弾道運動に移行します。 b. 外部電場なしで実験的に観察されたモーター粒子の不可逆性解析。分布の色分けは、\(T=\frac{1}{f}=0.2\,{\rm{s}}\) での時間間隔を示します。図 4e とは異なり、明確な傾向が欠けているため、繰り込みは適用されませんでした。

a、以下のサンプルを電気泳動した、5.5 mM MgCl2 を含む 1.5% アガロースゲルを 100 V の水浴上で 165 分間泳動したレーザースキャン画像。L、1 kb ラダー。 1、三角形のプラットフォーム; 2、台座。 3、ローターアームの最初の部分。 4、ローターアームの第2部分（延長部分）。 5、三角形のプラットフォームと台座ダイマー。 6、ローターアームダイマー。 7、完全に組み立てられた四量体。 P、ポケット。 Tet、四量体。 Dim1、三角形のプラットフォームと台座の二量体。 Dim2、ローターアームのダイマー。 b、Philips CM100顕微鏡で撮影したローターアームを取り付けたモーターアセンブリ全体のネガティブ染色TEM画像の例。スケールバー、100 nm。

このファイルには、補足図 1 ～ 4、トリミングされていないゲルスキャン、トリミングされていない TEM 顕微鏡写真、台座に使用されるカスタム足場シーケンス、および補足の表 1 ～ 5 が含まれています。

例示的な単一モーター粒子軌道、AC 磁場が最初にオフ、次にオンになります (青いトレース、図 3a)。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。 AC フィールドをオンにすると、粒子は事実上 CW 方向に回転します。右、ローター先端の累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 10,082; (実際の) ビデオ時間: 40.328 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

例示的な単一モーター粒子軌道、AC 磁場が最初にオフ、次にオンになります (オレンジ色のトレース、図 3a)。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。 ACフィールドをオンにすると、粒子は効果的にCCW方向に回転します。右、ローター先端の累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 13,538; (実際の) ビデオ時間: 54.152 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

段階的なAC磁場軸回転中に見られる例示的な単一モーター粒子の軌道（黒色のトレース、図3c）。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。粒子の角速度は、モーター本体に対する AC 磁場の軸の方向に依存します。 AC フィールド軸は 0° から 180° まで 5° ずつ回転しました。右、累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 16,000; (実際の) ビデオ時間: 64 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

段階的なAC磁場軸回転中に見られる例示的な単一モーター粒子の軌道（青いトレース、図3c）。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。粒子の角速度は、モーター本体に対する AC 磁場の軸の方向に依存します。 AC フィールド軸は 0° から 180° まで 5° ずつ回転しました。右、累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 16,000; (実際の) ビデオ時間: 64 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

AC周波数掃引中に見られる例示的な単一モーター粒子軌道（黒いトレース、図3e）。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。 AC 周波数は段階的に (100 Hz、10 Hz、5 Hz、1 Hz) 減少しました。右、累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 16,000; (実際の) ビデオ時間: 64 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

AC周波数掃引中に見られる例示的な単一モーター粒子の軌道（青いトレース、図3e）。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。 AC 周波数は段階的に (100 Hz、10 Hz、5 Hz、1 Hz) 減少しました。右、累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 16,000 (実際)。動画時間：64秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

AC電圧掃引中に見られる例示的な単一モーター粒子軌道（黒いトレース、図3f）。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。 AC 電圧を 0 V から 60 V まで段階的に増加させ、その後再び遮断しました。右、累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 12,000; (実際の) ビデオ時間: 48 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

AC電圧掃引中に見られる例示的な単一モーター粒子軌道(青いトレース、図3f)。左、例示的な単一粒子の生のビデオ。黄色の十字は、ローターアーム先端の追跡位置を示します。 AC 電圧を 0 V から 60 V まで段階的に増加させ、その後再び遮断しました。右、累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 12,000; (実際の) ビデオ時間: 48 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

AC 磁界の軸方向の関数として予想されるモーターの動作の図。左: 上、2 つのエネルギー最小値を特徴とする理想化されたモーターの想定された自由エネルギープロファイル。中央、外部交流磁場のエネルギー的寄与。下は、有効自由エネルギープロファイル (極座標でプロット)。緑色の線はローターアームの方向を示します。デカルト座標でプロットされた中央の自由エネルギープロファイル。緑色の点はローターアームの向きを示します。右、ランジュバンシミュレーション中に見られる累積角変位。このシミュレーションでは、AC フィールド軸が一定のフレーム数の間静止状態に保持され、粒子のダイナミクスが記録されました。次に、AC 磁場の軸が矢印で示すように異なる方向に更新されました。

AC 界磁周波数の関数としての予想されるモーターの動作の図。左: 上、2 つのエネルギー最小値を特徴とする理想化されたモーターの想定された自由エネルギープロファイル。中央、外部交流磁場のエネルギー的寄与。下は、有効自由エネルギープロファイル (極座標でプロット)。緑色の線はローターアームの方向を示します。デカルト座標でプロットされた中央の自由エネルギープロファイル。緑色の点はローターアームの向きを示します。右、ランジュバンシミュレーション中に見られる累積角変位。このシミュレーションでは、AC 場の周波数が一定のフレーム数の間固定に保たれ、粒子のダイナミクスが記録されました。次に、AC フィールド周波数が、示された AC フィールド周波数係数によって増加しました。

AC 磁界振幅の関数としての予想されるモーターの動作の図。左: 上、2 つのエネルギー最小値を特徴とする理想化されたモーターの想定された自由エネルギープロファイル。中央、外部交流磁場のエネルギー的寄与。下は、有効自由エネルギープロファイル (極座標でプロット)。緑色の線はローターアームの方向を示します。デカルト座標でプロットされた中央の自由エネルギープロファイル。緑色の点はローターアームの向きを示します。右、ランジュバンシミュレーション中に見られる累積角変位。このシミュレーションでは、AC 場の振幅が一定のフレーム数の間静止状態に保たれ、粒子のダイナミクスが記録されました。次に、AC 磁界の振幅が、示された AC 磁界強度係数によって増加しました。

1 つの巻き取りサイクル中のねじりバネによる単一モーター粒子の軌道の例 (左下のトレース、図 4g)。左の、巻き取り (AC フィールドオン) と巻き戻し (AC フィールドオフ) の 1 サイクル中のねじりバネを備えた例示的なローターの生のビデオ。ローターアーム (黄色の十字) の追跡位置が重ね合わされています。右、対応する累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 14,000; (実際の) ビデオ時間: 56 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

2 つの巻き取りサイクル中のねじりバネによる単一モーター粒子の軌道の例 (右上のトレース、図 4g)。左の、巻き取り (AC フィールドオン) と巻き戻し (AC フィールドオフ) の 2 サイクル中のねじりバネを備えた例示的なローターの生のビデオ。ローターアーム (黄色の十字) の追跡位置が重ね合わされています。右、対応する累積角変位。元のビデオは 250 フレーム/秒で取得されました。収集された総フレーム数: 14,000; (実際の) ビデオ時間: 56 秒。元の画像スタックの 2 フレームごとにエクスポートされました。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Pumm, AK.、Engelen, W.、Kopperger, E. 他 DNA折り紙の回転ラチェットモーターです。ネイチャー 607、492–498 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-04910-y

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 9 月 16 日

受理日: 2022 年 5 月 25 日

公開日: 2022 年 7 月 20 日

発行日: 2022 年 7 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04910-y

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

自然 (2023)

ネイチャーコミュニケーションズ (2023)

ネイチャーナノテクノロジー (2023)

NPGアジアマテリアルズ（2023年）

ネイチャーナノテクノロジー (2023)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

前: インテル Arm チップ製造: インテルは、Arm オンチップ製造との互換性を考慮して方向転換を目指す次: 下院共和党が債務制限法案を可決、バイデンとの衝突への道を開く

お問い合わせを送信

送信