FGFホルモンシグナル伝達の構造基盤

Oct 28, 2023

自然 (2023)この記事を引用

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

α/βKlotho 共受容体は、線維芽細胞成長因子 (FGF) ホルモン (FGF19、FGF21、および FGF23)1、2 とそれらの同族細胞表面 FGF 受容体 (FGFR1 ～ 4) に同時に関与し、それによって内分泌 FGF-FGFR 複合体を安定化します 3、4、5、6 。 しかし、これらのホルモンは、FGFR の二量体化/活性化を誘導し、その必須の代謝活性を引き出すための追加の共受容体としてヘパラン硫酸 (HS) プロテオグリカンを依然として必要とします6。 HS のコレセプターの役割を支える分子機構を明らかにするために、FGFR1 の「c」スプライス アイソフォーム (FGFR1c) を特徴とする 3 つの異なる 1:2:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS 四次複合体の低温電子顕微鏡構造を解析しました。 、受容体成分としてＦＧＦＲ３（ＦＧＦＲ３ｃ）またはＦＧＦＲ４。 これらの構造は、細胞ベースの受容体相補性およびヘテロ二量体化実験によって裏付けられ、単一の HS 鎖により、1:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho 三元複合体内の FGF23 とその一次 FGFR が、単独の二次 FGFR 分子を共同でリクルートすることを可能にして、非対称受容体の二量体化と活性化。 ただし、αKlothoは二次受容体の動員/二量体化には直接関与しません。 また、受容体二量体化の非対称モードが、HS 依存的にのみシグナルを伝達するパラクリン FGF にも適用できることも示します。 私たちの構造的および生化学的データは、現在の対称的な FGFR 二量体化パラダイムを覆し、ヒトの代謝性疾患および癌の治療薬として FGF シグナル伝達 2 の調節因子を合理的に発見するための青写真を提供します。

哺乳動物の線維芽細胞成長因子 (FGF) ファミリーは、5 つの傍分泌サブファミリーと 1 つの内分泌サブファミリーに配置された 18 個の β トレフォイル相同ドメイン含有ポリペプチドで構成されています 7。 傍分泌サブファミリーは胚発生中の複数の事象を支配する8一方、内分泌サブファミリーのメンバー（FGF19、FGF21、FGF23）は胆汁酸、脂質、グルコース、ビタミンD、ミネラルイオンの恒常性を調節するホルモンである1、4、9、10。 FGF ホルモンは、II 型糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、胆汁酸性下痢、腎リン酸消耗障害、慢性腎臓病など、さまざまな代謝疾患の治療における有望な標的です。 14、15、16、17、18、19。 FGF は、1 回膜貫通型 FGF 受容体チロシンキナーゼ (FGFR1 ～ 4) に結合し、二量体化し、それにより活性化することによってその作用を媒介します 20,21。 原型的な FGFR の細胞外領域には、3 つの免疫グロブリン (Ig) 様ドメイン (D1、D2、および D3) が含まれています。 D2、D3、および短い D2-D3 リンカーは、リガンド結合と受容体の二量体化に必要かつ十分です。 FGFR1 ～ FGFR3 では、2 つの相互に排他的なエクソン (「b」および「c」と呼ばれる) の選択的スプライシングにより、これら 3 つの FGFR の D3 ドメイン内の主要なリガンド結合部位の組成が変化し、主要な FGFR アイソフォームの数が効果的に 7 つに拡大されます。 (つまり、FGFR1b ～ 3b、FGFR1c ～ 3c、および FGFR4)22、23、24。

パラクリン FGF は、同族 FGFR と安定に結合して二量体化するための必須共受容体としてヘパラン硫酸 (HS) グリコサミノグリカンに依存しています。 HS は、すべての組織の細胞外マトリックスで豊富に発現される HS プロテオグリカン (HSPG) の直鎖状グリカン鎖です 25。 2:2:2 FGF2 – FGFR1c – HS 二量体の結晶構造によれば、HS はパラクリン FGF および FGFR の HS 結合部位に同時に関与し、それによって FGF – FGFR の近接性が強化されます。 そうすることで、HS (1) は 1:1 FG-FGFR 結合親和性を強化します。 (2) 2 つの 1:1 複合体間の相互作用を強化して、二重対称の 2:2 二量体を生成します 26。 細胞外 FGFR 二量体化は、(A) ループ チロシン トランスリン酸化、ひいてはキナーゼの活性化と細胞内シグナル伝達を媒介する細胞内キナーゼ ドメインの熱力学的に弱い非対称複合体の形成を促進します 27。

FGF ホルモンの HS 結合部位は、組成的にも立体構造的にもパラクリン FGF の HS 結合部位から分岐しており、HS28 に対する親和性が劇的に弱くなっています。 その結果、FGF ホルモンは細胞外マトリックス内の HSPG による捕捉を回避し、循環に入ることができます。 さらに、FGF ホルモンは、その主要な受容体結合残基が置換されているため、FGFR に対して弱い親和性を持っています 28,29。 これらの構造的および生化学的特異性はホルモンの作用機序を与える一方で、HS では内分泌 FGF が FGFR に結合して受容体の二量体化を誘導するには不十分になります。 実際、これらの欠陥を補うために、FGF ホルモンはシグナル伝達の追加の共受容体として αKlotho または βKlotho に絶対的に依存するように進化しました。 α- および βKlotho は、2 つのタンデムグリコシダーゼ様ドメイン (KL1 および KL2) からなる大きな細胞外ドメインと、短い細胞内ドメインを備えた 1 回膜貫通タンパク質です 3,5。 αKlotho (またはβKlotho) コレセプターは、FGF ホルモンとその同族 FGFR に同時に結合し、それによって内分泌 FGF の FGFR への結合を強化します。 Klotho 共受容体は、独自の FGF ホルモンおよび FGFR 結合特異性を有しており、これらが最終的に内分泌 FGF の FGFR 結合特異性および標的組織/臓器選択性を決定します。 αKlothoはFGF23のみに結合しますが(参考文献30)、βKlothoはFGF19とFGF21の両方に結合します(参考文献31、32、33、34)。 FGFR 相互作用に関しては、αKlotho と βKlotho は FGFR1c と FGFR4 に対して共通の特異性を示しますが、どちらも FGFR1 ～ 3 の「b」スプライス アイソフォームを認識しません。 しかし、それらはFGFR2cおよびFGFR3cに対して反対の特異性を示し、αKlothoはFGFR3cには結合するがFGFR2cには結合せず、βKlothoはFGFR2cに結合するがFGFR3cには結合しない(参考文献35)。

FGF23シグナル伝達におけるαKlothoの共受容体機構は、FGF23、FGFR1cリガンド結合ドメイン6、およびαKlothoの可溶性細胞外ドメイン（膜貫通型の脱落を介して生成される天然に存在するアイソフォーム）を含む三元複合体の結晶構造によって解明された36,37。 この構造では、長いα1β1ループ（受容体結合アーム（RBA）と呼ばれる）がαKlothoのKL2ドメインから伸び、FGFRのD3ドメインの疎水性溝（FGFR1c-3cおよびFGFR4の保存された特徴）を挟み込んでいます。 KL1 と KL2 の間の接合部の裂け目には、FGF23 の長い C テールが組み込まれています。 そうすることで、αKlotho は FGF23 と FGFR の近接性と複合体の安定性を強化します。 HSの役割に関して、我々は以前、HSが2つの1:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho複合体を集合させて、2を彷彿とさせる対称的な2:2:2:2 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS四次シグナル伝達ユニットを形成できると仮定しました。 :2:2 パラクリン FGF-FGFR-HS 二量体 6. FGFホルモンによる二重共受容体（αKlothoとHS）依存性のFGFR二量体化/活性化の根底にある機構を確立するために、我々は、生理学的に考えられる3つのFGF23-FGFR-αKlotho-HS四次複合体すべての極低温電子顕微鏡（クライオEM）構造を解明した。 予想外なことに、これらの構造は、包括的な細胞ベースのデータによって裏付けられており、HS が 1:1:1 FGF23-FGFR-αKlotho 内での FGF23 とその一次 FGFR と二次単独 FGFR との相互作用を強化し、それによって非対称受容体の二量体化と活性化を誘導することが明らかになりました。 特に、受容体二量体化の非対称モードはパラクリン FGF に一般化可能であり、FGFR の二量体化と活性化に関する現在の対称モデルを覆します 26。

我々は、全長成熟ヒト FGF23、FGF23 の 3 つのヒト同族 FGFR（つまり、FGFR1c、FGFR3c、 FGFR4）、ヒトαKlothoコレセプターの外部ドメイン全体、および完全硫酸化ヘパリン十二糖（以下、HSと呼びます）。 得られた 3 つの四次複合体 (FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS、FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS、および FGF23-FGFR4-αKlotho-HS) をサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって単離し、ガラス化に直接使用しました。クライオ EM 画像の収集と構造決定 (拡張データ図 1、拡張データ表 1、および補足図 2)。 私たちの予測に反して、3 つのクライオ EM 構造はすべて、同一の非対称 1:2:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS 四元集合体を明らかにしており、HS により 1:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho 三元複合体が唯一の FGFR 鎖 (三元複合体内の「一次」受容体 FGFRP と区別するために FGFRS と呼ばれる) (図 1)。 各四次複合体の膜遠位端で、HSは、FGF23、FGFRP、およびFGFRSの並置されたHS結合部位と三者相互作用に関与します（図2a）。 そうすることで、HSは、FGF23-FGFRP-αKlotho三元複合体からのFGF23とFGFRPとFGFRS鎖との相互作用を増強し、したがって受容体（つまり、FGFRP-FGFRS）の二量体化を誘導します（図3a）。 注目すべきことに、FGFR鎖のC末端の近接性と配向（細胞膜に対して垂直）（約25Å離れている）は、細胞内キナーゼドメイン27のAループリン酸転移非対称二量体の形成を黙認している（拡張データ図2a）。 αKlotho は FGFRS に直接関与しませんが、FGF23-FGFRP 複合体を安定化することによって FGFRS の動員を制御します。 αKlothoの支援がなければ、HSは二次FGFRSを動員するために必要な安定したFGF23-FGFRP複合体を独立して生成することができません。 実際、細胞ベースの実験により、FGF23シグナル伝達が厳密にαKlotho依存性であることが確認されました（拡張データ図2b）。 1:2:1:1 FGF23-FGFR-αKlotho-HS 四元集合体内の FGF23-FGFRP-αKlotho 三元複合体の立体構造は、HS を含まない FGF23-FGFR-αKlotho 三元複合体の X 線構造と類似しています。 （二乗平均平方根偏差（RMSD）はわずか 1.16 Å、拡張データ図 2c）6. ただし、四次複合体のFGFRSコンポーネントは、リガンド結合と互換性のない歪んだ立体構造を採用しているため、四次複合体の明確な非対称性が説明されています（補足図4）。

閾値レベル 0.6 で表示された FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS (a)、FGF23 – FGFR3c – αKlotho – HS (b)、および FGF23 – FGFR4 – αKlotho – HS (c) の四次複合体の低温 EM 再構成の全体図。それぞれ0.45と0.5。 四次複合体は、垂直軸に沿った 180 度の回転によって関連付けられた 2 つの異なる方向で示されています。 FGF23 はオレンジ色、αKlotho は濃い青、HS はマゼンタで示されています。 一次受容体 (FGFRP) と二次受容体 (FGFRS) は、FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 複合体では緑色と水色、FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS 複合体では黄褐色とピンク、そして金色と淡黄色で示されています。 FGF23 – FGFR4 – αKlotho – HS 複合体。 αKlotho の 2 つのタンデム グリコシダーゼ様ドメイン (KL1 および KL2) と RBA が標識されています。 3 つの 1:2:1:1 四次複合体すべてに見られる余分な弱い密度 (灰色) の関連性については、補足図 3 で説明します。

a、FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS 非対称四次複合体は、図1a（左）と同じ配向で漫画（FGF23、FGFRおよびHS）と表面（αKlotho）のハイブリッドとして表示されます。 b、HSとFGF23、FGFRPおよびFGFRSとの三者相互作用を示す、パネルaの四角で囲まれた領域の拡大図。 HS 相互作用残基は棒として示され、標識されています。 この図および後続の図における水素結合は黒い破線で表されます。 図全体を通して、窒素原子、酸素原子、硫黄原子はそれぞれ青、赤、黄色に色付けされています。 すべての構造図は Pymol (v.2.5.2) を使用して作成されました。 c、L6-FGFR1cWT、L6-FGFR1cΔHBS1、L6-FGFR1cΔHBS1またはL6-FGFR1cΔHBS1+2を、FGF23WT + αKlothoまたはFGF23R48A/R140A (FGF23ΔHBS) + αKlothoの20 nM 1:1混合物で共処理しました(L6-FGFRの場合) 1cWTのみ）または未処理のまま放置されます。 全細胞溶解物を、抗 pY656/Y657-FGFR、抗 pY783-PLCγ1、抗 pY196-FRS2α、抗 pT202/Y204-ERK、および抗 β-チューブリン抗体 (ローディング コントロール) で免疫ブロットしました。 d、PLAによって視覚化された、FGF23ΔHBSおよびFGFR1cΔHBS変異体のFGF23-FGFR1c-αKlotho-HS四次複合体の形成を誘導する能力の喪失。 赤いスポットは細胞表面上の FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS 四次複合体を示し、青く染まった大きな円/楕円は細胞核です。 FGF23WT 処理 L6-FGFR1cWT 細胞と比較して、FGF23ΔHBS 処理 L6-FGFRcWT および FGF23WT 処理 L6-FGFR1cΔHBS 細胞では赤色スポットがはるかに少ないことに注意してください。 スケールバー、10μm。 イムノブロット (c、野生型 FGFR1 および FGF23 に対して正規化、n = 3 の生物学的に独立した実験) および PLA (d、n = 2 つの生物学的に独立した実験からランダムに選択された 6 つの顕微鏡視野) は、「方法」セクションに記載されているように定量され、次のように表示されます。平均±標準偏差。 P 値は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較事後検定によって決定されました。

ソースデータ

a、漫画（FGF23およびFGFR）と表面（αKlotho）の混合としてのFGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS複合体構造の表現。 この図は、図 1a (右) の図を垂直軸に沿って 90 度回転させたものです。 FGFR1cP-FGFR1cS 二量体界面の接触部位 1 と接触部位 2 は、それぞれ青と黒の四角で囲まれています。 αKlotho は FGFR1S のリクルートに直接関与していないことに注意してください。 左、FGFR1cP の D2 ドメイン、FGFR1cS の D2、D2-D3 リンカー、および D3 が関与する部位 1 の拡大図。 右、FGFR1cP と FGFR1cS の D3 ドメイン間の部位 2 の拡大図。 相互作用する残基の側鎖は棒として示されています。 選択した二次構造要素にはラベルが付けられます。 疎水性接触は半透明の表面として強調表示されます。 Cu2+ イオン (オレンジ色の球) は、FGFR1cP および FGFR1cS の類似のヒスチジン残基によって配位されています。 Cu2+ の割り当ては、FGFR の細胞外ドメインとの特異的な Cu2+ 相互作用を示唆する以前の文献に基づいています 39。 Cu2+ イオンはおそらく、最小限にグリコシル化された FGFR 細胞外ドメインを分泌する HEK293S GnTI- 細胞の増殖に使用される細胞培養培地 (DMEM および DME/F12) に由来すると考えられます。 b〜d、未刺激、またはFGF23（20nM）およびαKlotho（20nM）で共刺激されたFGFR1c（b）、FGFR3c（c）またはFGFR4（d）発現L6細胞株から図2cのようにプローブされた全細胞抽出物のイムノブロット分析。 免疫ブロットデータは、「方法」セクションに記載されているように定量され、平均±標準偏差として表示されます。 データは野生型 FGFR および FGF23 に対して正規化され、n = 3 の生物学的に独立した実験。 P 値は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較事後検定によって決定されました。

ソースデータ

FGF23-HS相互作用は、FGF23のコア内の非定型HS結合部位の3つの残基（Arg48、Arg140、およびTyr154）によって媒介されます（図2b）。 FGF23-HS接触と比較して、HSは2つのFGFR鎖のD2ドメインにおいてHBSとより広範に相互作用し、FGFR1cPの残基Lys177、Lys207、Arg209およびSer214およびFGFR1cSの残基Lys175、Lys177、Val208、Arg209およびThr212が関与する（図2b）。 ）。 受容体（つまり、FGFRP-FGFRS）二量体化の誘導におけるHSとFGF23、FGFR1cPおよびFGFR1cSの三者相互作用の生理学的重要性を検証するために、我々はFGF23（FGF23ΔHBS）およびK175Q/K177QにR48A/R140A二重変異を導入した。およびＫ２０７Ｑ／Ｒ２０９Ｑ二重変異（ＦＧＦＲ１ｃΔＨＢＳ１およびＦＧＦＲ１ｃΔＨＢＳ２）を個別にまたは組み合わせて（Ｋ１７５Ｑ／Ｋ１７７Ｑ／Ｋ２０７Ｑ／Ｒ２０９Ｑ、ＦＧＦＲ１ｃΔＨＢＳ１＋２と呼ばれる）、完全長ＦＧＦＲ１ｃとなる。 野生型 FGFR1c (FGFR1cWT) とその変異型は、αKlotho および FGFR 欠損細胞株であるラット骨格筋芽細胞 (L6) の表面に安定して発現されました。 細胞溶解物のエンドグリコシダーゼ H (Endo H) およびペプチド:N-グリコシダーゼ F (PNGase F) 処理とそれに続く FGFR 特異的抗体によるイムノブロット分析により、変異した FGFR1c 変異体には複合糖が含まれていることが示され、これはそれらが細胞表面に存在することを意味します (拡張)データ図 3a)。 FGF23WT サンプルと FGF23ΔHBS サンプルの均一性/量が等しいことは、SDS-PAGE によって検証されました（補足図 2d）。 FGF23WT と L6-FGFR1cWT の可溶性 αKlotho を併用処理すると、A ループ チロシン、その 2 つの直接基質 PLCγ1 (制御 Y783 上) および FRS2α (Grb2 リクルート部位 Y196 上) での FGFR1c のリン酸化によって測定されるように、強力な FGFR1c 活性化/シグナル伝達が誘導されました。そしてその後の RAS マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) 経路の活性化は、T202/Y204 上の細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) のリン酸化によってモニタリングされます。 対照的に、FGFR1cΔHBS1およびFGFR1cΔHBS2二重変異体は両方とも、FGF23シグナル伝達を誘導する能力に大きな損失を被り、FGFR1cΔHBS1+2四重変異体は完全に沈黙した（図2c）。 同様に、FGF23ΔHBSは、可溶性αKlothoの存在下でL6-FGFR1cWTを活性化する能力が著しく遅延した。 FGFR 活性化/シグナル伝達データは、近接ライゲーション アッセイ (PLA) データによって反映されました。 具体的には、FGF23WT と αKlotho を併用処理すると、L6-FGFR1cWT 細胞株の表面に大量の強力な点状の蛍光シグナルが出現しました。 対照的に、共処理すると、FGFR1cΔHBS1、FGFR1cΔHBS2、およびFGFR1cΔHBS1+2細胞株の表面には蛍光シグナルがはるかに少なくなりました。 同様に、FGF23ΔHBSおよび可溶性αKlothoで共処理した場合、L6-FGFR1cWT細胞株の表面に存在する蛍光ドットは著しく減少しました（図2d）。 これらの細胞ベースのデータは、FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 四次細胞表面シグナル伝達複合体の形成を誘導する際に、FGF23-HS および FGFR1c-HS 接触が不可欠であることを裏付けています。 クライオ EM 構造における 1:2:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS の化学量論と一致して、サイズ排除クロマトグラフィー – 多角光散乱実験により、FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS 四次複合体が次のように移動することが示されました。計算上の分子量が約220 kDaの単一種であり、1:2:1:1 FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HSの理論値（215 kDa）と密接に一致します（補足図2e）。

FGFRP鎖とFGFRS鎖の両方の3つのサブドメイン（つまり、D2、D2-D3リンカー、およびD3）はすべて、FGFRSの三元複合体への動員に関与し、したがって受容体の二量体化の促進に関与します（図3a）。 FGFRP-FGFRS の直接接触は、適度な溶媒露出表面積 (1542.6 Å2) を埋め、3 つのクライオ EM 構造間で保存されます。 FGFRP-FGFRS インターフェイスは 2 つのサイト (つまり、サイト 1 と 2) に分割できます。 サイト 1 では、FGFRP の D2 の底部 (C 末端) 隅の不連続ループ領域 (つまり、βA' – βB および βE – βF ループ) の残基が、FGFRS の D2、D2 – D3 リンカー、および D3 に対して非対称にパックされます。 (図3a)。 サイト2では、D2-D3リンカー、βA鎖、βA-βA'ループ、およびD3のβB'鎖を含む一連の連続した残基が、二次受容体の対応する領域と擬似対称的に結合します（図3aおよび補足）。表1）。 注目すべきことに、FGFRP-FGFRS界面は、FGFRSの2つの重要なリガンド結合残基、すなわちArg250とSer346をトラップし、さらにFGFRSからリガンド結合を奪います（補足図4b）。

我々は、全長 FGFR1c (E249A、R254A、I256A、Y280A)、FGFR3c (E247A、R252A、I254A、Y278A)、またはFGFR4 (E243A、R248A、I250A、Y274A)。 さらに、3つの四次複合体の代表として、FGFR1cP-FGFR1cS二量体界面の部位1を標的とするために、A170D / A171D / S219K三重変異をFGFR1cに導入しました（図3a）。 全長 FGFR1c、FGFR3c、および FGFR4 変異体は、それらの野生型対応物とともに L6 細胞で安定して発現されました。 上記のように、Endo H 感受性を使用して、変異が受容体のグリコシル化/成熟および細胞表面提示に影響を与えないことを確認しました（拡張データ図 3b-d）。 FGFR1cI256A およびその対応する FGFR4I250A 変異体は別として、すべての変異体は、総 FGFR タンパク質様野生型 FGFR に対して Endo H 耐性の比が同等でした。 これらのデータは、FGFR1cI256A および対応する FGFR4I250A のみが細胞表面発現を減少させたことを示唆しています。 L6-FGFR1cWT細胞株の場合と同様に、L6-FGFR3cWTおよびL6-FGFR4WT細胞株をFGF23と可溶性αKlothoで共処理すると、FGFRおよび下流のPLCγ1/FRS2α/ERKシグナルトランスデューサーのリン酸化/活性化によって検出されるように、FGFRシグナル伝達が強力に刺激されました。 対照的に、変異したFGFR1c、FGFR3c、およびFGFR4を発現する細胞では、FGFR Aループのチロシンリン酸化が減少し、PLCγ1、FRS2α、およびMAPKの活性化が減少しました（図3b-d）。 対応する FGFR3cI254A のグリコシル化と細胞表面発現は影響を受けないため、FGFR1cI256A および FGFR4I250A によるシグナル伝達の障害が細胞表面発現の低下のみによるとは考えにくいです。

FGF23 はまた、FGFRS を三元複合体にリクルートすることにも関与し、したがって FGFRP-FGFRS の二量体化の強化にも関与します。 これらの二次的な FGF23-FGFRS 接触は、FGF23 の剛直な三つ葉コアと柔軟な N 末端の両方によって媒介されます。 具体的には、FGF23の三つ葉コア内のβ8-β9およびβ10-β12ループは、FGFRS D2ドメインの下端（C末端）でβC-βDおよびβE-βFループと係合します（図4a）。 並行して、FGF23 N末端の最遠位端の疎水性残基がFGF23-FGFRP-αKlotho複合体から伸び、αKlothoのRBAが関与するFGFRPのD3溝に対応するFGFRS D3ドメインの疎水性溝と相互作用します(図 4a および拡張データ図 4a)。 そうすることで、FGF23 N末端は別のαKlothoのFGFRSへの結合を妨げる可能性が高く、したがって四次複合体の非対称性に寄与します。 HS を含まない 1:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho 複合体の結晶構造と比較すると、FGF23 の N 末端は 1:2:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS 四次構造において大きな構造変化を示します。複雑です (拡張データ図 4b–d)。 注目すべきことに、3つのクライオEM構造すべてにおいて、FGF23 N末端の電子密度は十分に定義されておらず、これは、FGF23 N末端がかなり縮退的かつ柔軟な方法でFGFRS D3に関与していることを示唆しています（図1a〜cおよび拡張データ図4e）。 ）。 FGF23 N末端とFGFRS D3の相互作用は、FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS複合体の300 nsの全原子分子動力学（MD）シミュレーションによって確認されました（拡張データ図4f–i）。 FGFRP-FGFRS界面と同様に、FGF23-FGFRS界面（補足表2）も3つの四次複合体間で保存されており、かなり控えめな表面露出領域（1668.6Å2）をマスクします。 注目すべきことに、FGF23のN末端とFGFRSのD3は、FGFRP-FGFRS界面の部位2の近くで互いに係合しています（図4a）。 これは、FGF23-FGFRS および FGFRP-FGFRS の接触が協調して作用して、FGFRS を三元複合体に動員し、受容体の二量体化 (つまり、FGFRP-FGFRS) を促進することを意味します。

a、図1aと同じビューでのFGF23-FGFR-αKlotho-HS構造の漫画表現（右）。 オレンジと黒のボックスは、FGF23 と FGFRS の間の 2 つの接触領域、つまり FGF23core:FGFR1cS D2 ドメイン (左、オレンジのボックス) と FGF23NT:FGFR1cS D3 ドメイン (右) を示します。 b、L6-FGFR1cWT細胞を濃度を増加させながらFGF23WT、FGF23ΔNTまたはFGF23ΔSRBSで処理し、図2のように全細胞溶解物をプローブしました。FGF23WT、FGF23ΔNT、およびFGF23ΔSRBSサンプルの均一性/量が等しいことはSDS-PAGEによって検証されました（補足図2）。 2d）。 c、PLAによって評価された、FGF23WTと比較した、FGF23ΔNTおよびFGF23ΔSRBS変異体のFGF23-FGFR-αKlotho-HS四次複合体形成（つまり、受容体の二量体化）を誘導する能力の喪失。 FGF23WTと比較して、FGF23変異体で刺激された細胞では赤いスポットがはるかに少ないことに注意してください。 d、L6-FGFR1cWT細胞をFGF23WT（40nM）単独、FGF23ΔSRBS（40nM）またはFGF23ΔNT（40nM）と混合したFGF23WT（40nM）で処理し、全細胞抽出物をpFGFR抗体でプローブした。 スケールバー、10μm。 免疫ブロット法 (b および d、n = 3 つの生物学的に独立した実験) および PLA (c、n = 2 つの生物学的に独立した実験からランダムに選択された 6 つの顕微鏡視野) は、「方法」セクションに記載されているように定量され、平均 ± 標準偏差として表示されます。 P 値は、二元配置 ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較事後検定によって決定されました。

ソースデータ

次に、1:2:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS 四次シグナル伝達複合体の形成に対する、FGF23 – FGFRS の二次接触の干渉の影響を研究しました。 この目的のために、我々は 2 つの FGF23 変異体を生成しました。1 つは最初の 12 個の N 末端残基 (つまり、Y25 から W36、FGF23ΔNT と呼ばれる) を欠き、もう 1 つは FGF23 のコア領域内に M149A/N150A/P151A 三重変異を保有しています。 （FGF23ΔSRBSと呼ばれます）。 クライオEM構造によれば、M149A / N150A / P151A三重変異およびN末端切断は、それぞれFGF23とFGFRSのD2およびD3ドメインとの二次相互作用を無効にし、したがってFGF23シグナル伝達を損なうと予測されます（図4a）。 これをテストするために、FGFR1cWT と膜貫通型 αKlotho を共発現する L6 細胞株を生成し、増加する濃度の FGF23WT、FGF23ΔNT または FGF23ΔSRBS に曝露しました。 増加する濃度のリガンドの受容体二量体化/活性化効果を、FGFR Aループチロシンリン酸化のイムノブロッティングおよびPLAによって評価しました（図4b、c）。 用量反応曲線の比較により、すべての濃度で、FGF23ΔNT も FGF23ΔSRBS も、両方のアッセイで FGF23WT が発揮する最大活性 (Emax) に到達できないことが示されました。 さらに、FGF23WTと組み合わせると、FGF23ΔSRBSとFGF23ΔNTの両方が競合アンタゴニストとして作用し、FGFR1c活性化の純減少を引き起こしました（図4d）。 ただし、FGF23ΔNTと比較して、FGF23ΔSRBSは二量体化/シグナル伝達能力の大きな損失を示しました（図4b〜d）。これは、FGF23のコアを介して媒介されるFGF23-FGFRS接触が、FGF23の全体的な安定性と機能により多く寄与していることを意味します。 FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS 四次シグナル伝達複合体は、FGF23 N 末端によって媒介されるシグナル伝達複合体よりも優れています。

我々は、FGF23-FGFR-αKlotho-HS 四次シグナル伝達複合体の非対称性を調査するために、細胞ベースの受容体相補アッセイを考案しました。 具体的には、非対称二量体化において一次受容体と二次受容体が果たす異なる役割に基づいて、一次受容体または二次受容体のいずれかとして排他的に作用できる2つのFGFR1c変異体を操作した。 私たちは、これらの変異体は個別には機能不全であっても、相互に補完し合い、FGF 23 と αKlotho に応答して機能的な 1:2:1:1 四次複合体を形成するはずであると推論しました（図 5a および拡張データ図 5a、b）。 一次受容体としてのみ機能する FGFR1c 変異体を生成するために、その D2 ドメインに I203E/S223E 二重変異を導入しました。 上述のように、FGFR1cSのこれら2つの残基は、FGF23のコア（つまり、FGF23-FGFR1cS界面、図4a）の残基と疎水性および水素結合接触を行っており、これはFGFR1cSを三元複合体にリクルートするために不可欠です。これは、FGF23ΔSRBSの機能の重度の喪失によって暗示されます（図4b、c）。 ただし、FGFR1cP の対応する残基は四次複合体の形成には不要であり、溶媒にさらされています (拡張データ図 5b)。 その結果、得られた変異体FGFR1c（FGFR1cΔSLBSと呼ばれる）は、二次受容体として機能する能力を失うと予測されるが、一次受容体として機能する能力は保持しているはずである。 二次受容体としてのみ機能できる FGFR1c 変異体を作成するために、A167D/V248D 二重変異をその D2 ドメインに導入しました。 A167D/V248D二重変異は、FGF23とFGFR1P D2ドメイン間の高度に保存された水素および疎水性接触の形成を無効にします（拡張データ図5a、b）。 したがって、得られたFGFR1cA167D/V248D変異体(FGFR1cΔPLBSと呼ばれる)は、一次受容体として機能する能力を失う(すなわち、三元複合体を形成する)と予測される。 ただし、FGFR1cS の対応する残基は四次複合体形成において何の役割も果たさず、完全に溶媒にさらされているため、FGFR1cΔPLBS は二次受容体として機能する能力を保持しているはずです。

a、FGF23とαKlothoの共処理に応答して、FGFR1cΔSLBSとFGFR1cΔPLBSが互いに補完し、1:1:1:1:1 FGF23-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLB-αKlotho-HS非対称複合体を形成できることを示す概略図。 b、FGFR1cWT、FGFR1cΔPLBS、およびFGFR1cΔSLBSを単独で発現する、またはFGFR1cΔSLBSとFGFR1cΔPLBSを共発現する未処理またはFGF23およびαKlothoで共処理したL6細胞株からの全抽出物のイムノブロット分析。図2のようにプローブされます。 c、FGF23、αKlothoおよびHSの存在下で、FGFR4ΔSLBS（一次受容体として機能する）は三元複合体を形成し、二次受容体としてFGFR1cΔPLBSを動員します。 d、FGFR4WT、FGFR4ΔSLBS単独、またはFGFR4ΔSLBSとFGFR1cΔPLBSを安定して発現するFGF23およびαKlotho共処理L6細胞株を、図2に示すように全細胞溶解物のウェスタンブロッティングを使用してFGFR活性化/シグナル伝達について分析しました。 e、それを示す概略図。パラクリン FGF1/4 および HS に対する応答、FGFR1cΔSLBS および FGFR1cΔPLBS は互いに補完し、1:1:1:1 FGF-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLBS-HS 非対称シグナル伝達複合体を形成する可能性があります。 f、FGFR1cΔSLBSおよびFGFR1cΔPLBSを個別に発現するか、またはそれらを共発現するL6細胞株をFGF1（1nM）で処理し、細胞抽出物を図2のように免疫ブロットした。 g、FGF1、HSおよびFGFR4ΔSLBS（一次受容体として機能する）を示す概略図）安定した複合体を形成し、その後二次受容体として FGFR1cΔPLBS を補充します。 ｈ、ＦＧＦＲ４ＷＴもしくはＦＧＦＲ４ΔＳＬＢＳを単独で発現する、またはＦＧＦＲ４ΔＳＬＢＳとＦＧＦＲ１ｃΔＰＬＢＳとを共発現するＬ６細胞株をＦＧＦ１（１ｎＭ）で処理し、細胞抽出物を図２のように免疫ブロットした。実験は生物学的三重反復で実施され、同様の結果が得られた。 CT、C末端。 NT、N末端。

相補性アッセイを実行するために、FGFR1cΔSLBS と FGFR1cΔPLBS を共発現する L6 細胞株 (L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS) を、FGFR1cΔSLBS (L6-FGFR1cΔSLBS) と FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔPLBS) を個別に発現する 2 つの対照 L6 細胞株とともに生成しました。 これら 3 つの細胞株および L6-FGFR1cWT (陽性対照) を、一定濃度の FGF23 および可溶性 αKlotho に時間間隔を増加しながら曝露しました。 FGFR1c シグナル伝達は、FGFR、PLCγ1、FRS2α のチロシンリン酸化、およびその後の MAPK 経路の活性化をモニタリングすることによって評価されました。 L6-FGFR1cWT細胞株と比較して、L6-FGFR1cΔPLBS細胞またはL6-FGFR1cΔSLBS細胞ではFGFRシグナル伝達は無視できました（図5b）。これは、これらの変異体がそれ自体でシグナル伝達能力のある四次複合体を形成できないことを意味します。 対照的に、FGFR1cΔSLBSとFGFR1cΔPLBSの共発現(図5b)は、FGFRシグナル伝達経路の強力な活性化をもたらした。 これらのデータは、FGFR1cΔSLBSがシグナル伝達能のあるFGF23-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLBS-αKlotho-HS四次複合体を形成する際にFGFR1cΔPLBSを補完することができ、FGFR1cΔSLBSが一次受容体の役割を引き受け、FGFR1cΔPLBSが二次受容体として採用されることを示唆しています（図5a）。 非対称のFGF23 – FGFR1cΔSLBS – FGFR1cΔPLBS – αKlotho – HSシグナル伝達複合体の形成は、PLAによっても検証されました（拡張データ図5c）。 L6-FGFR1cWT 細胞と比較して、FGF23 と αKlotho の共処理では L6-FGFR1cΔSLBS および L6-FGFR1cΔPLBS 細胞の表面に蛍光シグナルを生成できませんでした。これは、FGFR1cΔSLBS および L6-FGFR1cΔPLBS 変異体だけでは受容体二量体化（つまり、四次化）が起こらないことを意味します。複雑な形成）。 対照的に、L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS を共発現する細胞を FGF23 と αKlotho で刺激すると、豊富で強い蛍光点が出現しました。これは、FGFR1cΔSLBS と FGFR1cΔPLBS が互いに補完し合い、非対称な FGF23-FGFR1cΔSLBS-FGFR1cΔPLBS-αKlotho- に集合したことを示唆しています。 HS シグナル伝達複合体。

上で述べたように、FGFRP-FGFRS 界面と FGF23-FGFRS 界面は両方とも 3 つの四次複合体間でほぼ不変です。 この観察により、複合体の非対称性を調べる別の機会が得られました。 具体的には、一次FGFR1cPは二次受容体としてFGFR3cまたはFGFR4と対合して、機能的な1:2:1:1 FGF23–FGFR1c–FGFR3c–αKlotho–HSまたはFGF23–FGFR1c–FGFR4–αKloth–HSを生成できるはずであると推論しました。ヘテロ二量体四級複合体（図5c）。 この可能性をテストするために、本発明者らは、I197E/S217Eの二重変異を有するFGFR4変異体（FGFR1cΔSLBSに対応）を一次受容体として、FGFR1cΔPLBSを二次受容体として使用して、受容体相補アッセイを実施した。 FGFR1cΔPLBS と FGFR4ΔSLBS を共発現する L6 細胞株 (L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS)、および FGFR4WT (L6-FGFR4WT) および FGFR4ΔSLBS を個別に発現する対照細胞株 (L6-FGFR4ΔSLBS) を誘導しました。 これらの細胞株を FGF23 と αKlotho で同時処理し、四次シグナル伝達複合体の形成をイムノブロット分析と PLA で調べました。 FGFR1cΔSLBSおよびFGFR1cΔPLBSと同様に、FGFR4ΔSLBSもFGF23とαKlothoの共処理に応答して活性化されなかった。 しかし、L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS 共発現細胞株では、FGFR シグナル伝達経路の強力な活性化が起こりました（図 5d）。 細胞シグナル伝達データは PLA によって反映されました (拡張データ図 5c)。 具体的には、FGF23 および αKlotho による共刺激により、重要ではない蛍光シグナルが L6-FGFR4ΔSLBS 細胞株の表面に存在しました。 対照的に、L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS を共発現する細胞の表面には、大量の強力な点状の蛍光スポットが現れました。これは、FGF23-FGFR1c-FGFR4-αKlotho-HS ヘテロ二量体四次複合体が生細胞の表面に形成できることを示唆しています。 これらの細胞ベースの受容体の相補性とヘロ二量体化のデータは、構造的に推定された 1:2:1:1 FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS シグナル伝達複合体の非対称性を明確に裏付けています。

αKlotho共受容体はFGFRSの動員に直接関与していないため、FGF23-FGFR-αKlotho-HSのクライオEM構造によって明らかにされた受容体二量体化の非対称モードはパラクリンFGFにも関連している可能性があることが示唆されました。 この推測を検証するために、我々は、パラクリン FGF シグナル伝達を媒介する FGFR1c および FGFR2b の能力に対する非対称 FGFRP-FGFRS 二量体界面変異の影響を研究しました。 これら 2 つの FGFR アイソフォームは、それらの重複するユニークなリガンド結合特異性/乱交プロファイルのために選択されました (拡張データ図 5d)。 FGFR1c はパラクリン FGF1 (汎 FGFR リガンド) および FGF4 に応答し、FGFR2b は FGF1、FGF3、FGF7、FGF10、および FGF22 の作用を媒介します。 FGFR2b 研究では、野生型 (FGFR2bWT) または上記の FGFR1c 変異体に類似した FGFR2b 変異体 (つまり、FGFR2bE250A、FGFR2bR255A、FGFR2bI257A、および FGFR2bY281A) を発現する L6 細胞株を生成しました。 FGFR1c 変異体と FGFR2b 変異体は両方とも、リガンド誘導性チロシントランス自己リン酸化を受ける能力が損なわれており、これは PLCγ1 および FRS2α リン酸化の減少にも相反していました (拡張データ図 6)。

次に、FGF23 の場合と同様に、受容体相補性およびヘテロ二量体化アッセイを実施しました。 FGFR2b相補性研究のために、FGF23研究に使用されるFGFR1c細胞株に対応するL6-FGFR2bΔSLBS、L6-FGFR2bΔPLBSおよびL6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS細胞株を確立しました。 FGF1またはFGF4の刺激に応答して、FGFR1cΔPLBSまたはFGFR1cΔSLBSを単独で発現する細胞は、かなりのFGFR1cシグナル伝達を誘発できませんでしたが、L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS細胞は、強力なFGFR1c活性化とシグナル伝達で応答しました（図5e、f）。 同様に、FGF1、FGF3、FGF7、およびFGF10はそれぞれ、L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS共発現体においてのみFGFR活性化およびシグナル伝達を誘導した（拡張データ図7）。 最後に、パラクリン FGF による FGFR ヘテロ二量体化の可能性を次の点に焦点を当てて研究しました。(1) FGF1 による FGFR1c – FGFR4 および FGFR1b – FGFR2b のヘテロ二量体化。 (2) FGF10 による FGFR1b – FGFR2b ヘテロ二量体化。 (3) FGF3 による FGFR2b-FGFR3b ヘテロ二量体化。 FGFR1b – FGFR2b ヘテロ二量体化アッセイでは、FGFR2bΔSLBS と同等の FGFR1bΔSLBS を発現する L6 細胞株を生成しました。 FGF3 による FGF2b-FGFR3b ヘテロ二量体化では、野生型 FGFR3b (FGFR3bWT) を ΔPLBS 相当物として使用しました。これは、このアイソフォームが本来は FGF3 に応答しないためです。 FGF1は、FGFR1cΔPLBSおよびFGFR4ΔSLBS細胞株においてFGFRシグナル伝達を活性化できなかった。 しかし、FGF1刺激に応答して、FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBSを共発現する細胞株では強いFGFRシグナル伝達が見られました（図5g、h）。 同様に、FGF1とFGF10は両方とも、FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBSを共発現する細胞株でのみ強力なFGFR活性化/シグナル伝達を誘導しましたが、L6-FGFR1bΔSLBSおよびL6-FGFR2bΔPLBS細胞株では誘導しませんでした（拡張データ図8a〜c）。 最後に、FGF3は、FGFR2bΔSLBS + FGFR3bWT共発現細胞株においてシグナル伝達を誘発しましたが、L6-FGFR2bΔSLBSおよびL6-FGFR3bWT細胞においては誘発しませんでした（拡張データ図8d、e）。 これらの広範な細胞ベースのデータに基づいて、パラクリン FGF シグナル伝達は HS および Klotho 誘導性の内分泌 1:2 FGF23-FGFR 二量体を彷彿とさせる、HS 誘導性の非対称 1:2 FGF-FGFR 二量体を介して媒介されていると結論付けています（拡張データ図.9）。

この原稿で提示された 1:2:1:1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS 非対称四次複合体構造とそれを裏付ける生化学データは、Klotho と HS グリコサミノグリカン共受容体がどのように連携して作用し、FGF23 – FGFR – αKlotho – HS の非対称 1:2 内分泌 FGF – FGFR 二量体化を促進するかを明らかにしています。受容体活性化、ひいては FGF ホルモンシグナル伝達。 このモデルでは、Klotho 共受容体が FGF ホルモンとその一次受容体をつなぎ、1:1:1 の FGF-FGFRP-Klotho 三元複合体の状況で安定した内分泌 FGF-FGFRP 複合体を生成します。 そうすることで、Klotho 共受容体は、内分泌 FGF-FGFRP 複合体の安定化における HS の機能不全を効果的に相殺します (拡張データ図 9)。 安定化された内分泌 FGF-FGFRP 複合体は、HS コレセプターによって補助されて二次 FGFRS を動員します。 重要なことは、Klotho 共受容体依存性により、FGF ホルモンの作用部位が Klotho 発現組織/器官 (つまり、FGF23 の場合は腎臓および副甲状腺) に限定されることです。 FGFRSの動員におけるKlothoの直接的な役割の欠如と一致して、受容体二量体化の非対称モードがパラクリンFGFにも適用できることを示します。 FGF ホルモンとは異なり、パラクリン FGF は HS に対して実質的な親和性を持っているため、安定して FGFRP に結合し、FGFRS を動員するための必須共受容体として HS のみに依存することができます。 構造的類似性を共有しているにもかかわらず、Klotho および HS 誘発内分泌 1:2 FGF-FGFR 二量体は、HS 誘発パラクリン 1:2 FGF-FGFR 二量体よりも熱力学的に劣っています。 具体的には、FGF ホルモンの HS 結合親和性が弱いため、FGFRS は内分泌 1:2 FGF-FGFR 二量体への結合が弱く、これが傍分泌 FGF と比較して FGF ホルモンの受容体活性化/シグナル伝達能力が弱い原因となっています。 FGF シグナル伝達特異性の「閾値モデル」38。 注目すべきことに、非対称受容体二量体化モデルは受容体ヘテロ二量体化と互換性があり、これは FGF シグナル伝達を定性的および定量的に微調整するための追加機構として機能すると考えられます。

ライゲーション非依存性の In-Fusion HD クローニング キット (番号 639648、Clontech) を使用して、野生型全長ヒト FGFR2c、FGFR3c、およびヒトＦＧＦＲ１ｃレンチウイルス発現構築物について前述したプロトコールに従ったＦＧＦＲ４ ６． N末端にhisタグを付加したヒトFGF23（残基Tyr25からIle251）のpET-30aベースの細菌発現構築物は、以前に記載されている6。 FGFR3c (残基 Asp142 から Arg365、FGFR3cecto) および FGFR4 (残基 Asp142 から Arg365、FGFR4ecto) の細胞外リガンド結合領域 (つまり、D2-D3 領域) をコードする pHLsec 発現ベクターは、ヒトについて前述したのと同じ戦略に従って作成されました。 FGFR1cecto (参考文献 6)。 Q5部位特異的突然変異誘発キット(番号E0554S、New England Biolabs Inc.)を使用して、単一および複数の部位突然変異および切断を野生型タンパク質をコードする発現構築物に導入した。 発現構築物は、制限酵素消化および DNA 配列決定によって検証されました。

FGFR1c、3c、および 4 の最小限にグリコシル化された細胞外ドメインを生成するために、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ I (GnTI-) 欠損 HEK293S 細胞に、カチオン性ポリマーポリエチレンイミン (PEI、番号 23966-1、Polysciences, Inc.) を介してそれぞれの pHLsec 発現構築物を次のように一時的にトランスフェクトしました。公開されたプロトコル40。 次に、トランスフェクションの 24 時間後、トリプトン N1 (TN1、カタログ番号 19553、Organotechnie) を培地に添加して、タンパク質の発現を促進しました。 3日目に、1μlの馴化培地から分泌されたFGFR外部ドメインをヘパリンアフィニティーHiTrapカラム(番号17040703、GE Healthcare)で捕捉し、20カラム容量の塩勾配(0〜2M)で溶出した。 FGFRectoタンパク質を含む画分をプールし、5mlに濃縮し、Superdex-75ゲル濾過カラム(番号28989333、GE Healthcare)に適用した。 FGFRectoタンパク質を、1M NaClを含む25mM HEPES pH = 7.5緩衝液中で均一濃度で溶出した。 野生型および変異型 FGF23 タンパク質を大腸菌内で封入体として発現させ、in vitro でリフォールディングし、確立されたプロトコールに従って逐次陽イオン交換および SEC を使用して均一になるまで精製しました 6。 分泌された αKlothoecto は、記載されているように、ヘパリン アフィニティー HiTrap カラム、続いて SOUCRE Q アニオンおよび Superdex 200 カラム クロマトグラフィーを使用して、ヒト αKlotho の全細胞外ドメイン (残基 Met1 から Ser981、αKlothoecto) を安定して発現する HEK293S GnTI- 細胞株の馴化培地から精製しました。以前6.

FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS、FGF23 – FGFR3c – αKlotho – HS、または FGF23 – FGFR4 – αKlotho – HS 四次複合体は、FGF23 と FGFR 外部ドメインの 1 つである αKlothoecto およびヘパリン十二糖 12 (HO12、Iduron Ltd) を混合することによって調製されました。 1:1:1:1のモル比。 混合物を約5 mg ml-1に濃縮し、Superdex 200カラム(番号28989335、GE Healthcare)に適用し、100 mM NaClを含む25 mM HEPES pH = 7.5緩衝液中で均一濃度で溶出した。 ピーク画分を SDS-PAGE で分析し、最高濃度および純度の四次複合体を含む上部画分を、タンパク質の凝集を避けるためにさらに濃縮することなく、グリッドの調製に直接使用しました。 グリッド調製のための FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS、FGF23 – FGFR3c – αKlotho – HS および FGF23 – FGFR4 – αKlotho – HS 複合体の最終濃度は、それぞれ 1.5、2.4、および 1.5 mg ml-1 でした。

クライオ EM グリッドを準備するために、約 1.5 ～ 2.5 mg ml-1 の精製タンパク質複合体 2 ～ 3 μl をグロー放電金グリッド (UltrAuFoil) に適用しました。 次に、液体エタンに浸す前に、Mark IV Vitrobot (FEI) を使用して、湿度 100%、0 または 1 の力でグリッドを 1 ～ 2 秒間ブロッティングしました。 FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 複合体および FGF23-FGFR4-αKlotho-HS 複合体の顕微鏡写真は、K2 直接電子検出器を備えた Talos Arctica 顕微鏡で倍率 36,000 倍 (ピクセルあたり 1.096 Å に相当) で取得されました。 使用した累積線量は、FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS および FGF23-FGFR4-αKlotho-HS でそれぞれ 50.37 e-/Å2 および 53.84 e-/Å2 でした。 FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS 複合体の顕微鏡写真は、K2 直接電子検出器とエネルギーフィルターを備えた Titan Krios 顕微鏡で収集されました。 使用した倍率は 130,000 倍、ピクセル サイズは 1.048 Å、累積線量は 72.44 e-/Å2 でした。 Leginon41 を使用して氷の厚さ 5 ～ 100 nm の穴をターゲットにした結果、3 つの四次複合体ごとに 10,186 枚、6,409 枚、および 16,602 枚の顕微鏡写真が収集されました。

WARP42 は、3 つすべてのクライオ EM データセットの動き補正とコントラスト伝達関数の推定に使用されました。 全体の解像度が 5.5 Å より悪い顕微鏡写真は除外されました。 使用された最終的な顕微鏡写真の数は、それぞれ 9,501 枚、5,164 枚、および 15,049 枚であり、各複合体について 100 万個を超える粒子が得られました。 次に、粒子スタックを crioSPARC43 にインポートして、2 次元分類、3 つまたは 4 つのモデルによる非経験的再構成、および 3 次元分類を行いました。 最後に、1,497,967 (FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS)、291,540 (FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS)、および 856,877 (FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) の粒子が C1 対称性による不均一リファインメントに使用され、結果として 2.74、3.20、およびそれぞれ3.03Åの分解能。 FGF23 – FGFR1c – αKlotho X 線構造 (PDB: 5W21) のコンポーネント/ドメインは、Chimera44 を使用してクライオ EM 密度マップに手動でドッキングされ、剛体が洗練されました。 その後、初期モデルは Coot45 で調整され、実空間は Phenix46 で洗練されました。 詳細化およびモデル統計を拡張データ表 1 に示します。各四元複合体の代表的なクライオ EM 画像、二次元クラス平均、および三次元マップを拡張データ図 1 に示します。

FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 四次複合体のクライオ EM 構造は、16 × 16 × 16 nm3 の水ボックス内で溶媒和されました。 CHARMM-GUI サーバーは、構成、トポロジー 47、48、49、50、および CHARMM36m フォース フィールド 51 を含むパラメーター ファイルを生成するために使用されました。 タンパク質分子に加えて、シミュレーション システムには約 138,073 個の水分子、393 個のナトリウムイオンおよび 393 個の塩化物イオン (タンパク質バッファーに存在する 150 mM NaCl を模倣) が含まれており、合計 439,298 個の原子が生成されました。 300 ns の全原子 MD シミュレーション軌道は、GROMACS 2021 (参考文献 52) を使用し、303 K で 2 fs のタイムステップを使用して生成されました。 シミュレーション中には三次周期境界条件が使用され、ファンデルワールス相互作用は 1 nm から 1.2 nm までオフにされました。 長距離静電相互作用は、粒子メッシュ Ewald (PME) 法を使用して計算されました。 エネルギー最小化は、最急降下アルゴリズムを使用して実行され、その後、力の拘束を 1000 kJ から徐々に減少させることによって、0.4 ns の一定の粒子数、体積、温度 (NVT) および 20 ns の一定の粒子数、圧力、および温度 (NPT) の平衡化シミュレーションが実行されました。 mol-1 nm-2 ～ 400 kJ mol-1 nm-2 (NVT ステージの場合)、および 400 kJ mol-1 nm-2 ～ 40 kJ mol-1 nm-2 (NPT ステージの場合)。 平衡化ステップの終了時に、すべての力の拘束が解除され、NPT アンサンブルで MD シミュレーションが実行されました。

HEK293T 細胞 (顕微鏡下での形態検査により確認、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) におけるマイコプラズマ陰性) をレンチウイルス ベクターのパッケージングと高力価ウイルス粒子の産生に使用しました。 L6筋芽細胞株(番号GNR 4、National Collection of Authenticated Cell Cultures)を、全長(膜貫通)ヒトFGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4およびそれらの変異体の安定発現のための宿主として使用した。 L6 細胞は内因的に HSPG を発現しますが、FGFR および αKlotho 共受容体を欠いているため、本来は FGF23 に対して非応答性です。 しかし、同族FGFRとαKlothoの制御された異所性共発現、または可溶性αKlothoectoの外因性補給により、これらの細胞はFGF23刺激に応答することができます。 したがって、L6 細胞は、生理学的環境における FGF23 シグナル伝達の再構成研究にとって優れた宿主です。 HEK293T 細胞と L6 細胞は両方とも、10% ウシ胎児血清 (FBS、番号 FSD500、ExCell Bio)、100 U ml-1 のペニシリン、および 100 μg ml を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、番号 C11995500BT、Gibco) で維持しました。 −１ ストレプトマイシン（番号Ｐ１４００、Ｓｏｌａｒｂｉｏ）。 HEK293T 細胞におけるウイルスのパッケージングと組換えレンチウイルス粒子の生成は、公開されているプロトコルを使用して実行されました 33。 個々の野生型または変異型 FGFR 細胞株を安定して発現させるために、2 × 105 個の L6 細胞を 6 ウェル細胞培養皿に播種し、ポリブレン (5 μg ml-1; no. sc-134220、サンタクルーズバイオテクノロジー）。 安定なトランスフェクタントは、G418 (0.5 mg ml-1、番号 HY-17561、MedChemExpress) またはハイグロマイシン (8 μg ml-1、番号 HY-B0490、MedChemExpress) を使用して選択されました。 FGFR1c+αKlothoTM 共発現細胞株の場合、FGFR1cWT (G418 耐性) を安定発現する L6 細胞に野生型または変異型膜貫通型 αKlotho (αKlothoTM) をコードするレンチウイルス粒子を感染させ、ハイグロマイシン (80 μg) を使用して共発現細胞を選択しました。 ml−1、番号 HY-B0490、MedChemExpress）。

細胞刺激研究では、親細胞と安定にトランスフェクトされた L6 細胞を 12 ウェル細胞培養プレートに 1 ウェルあたり 1 × 105 細胞の密度で播種し、24 時間維持しました。 翌日、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、その後12時間血清を枯渇させ、FGF23WTおよびαKlothoectoで5、10、20および40分間共刺激した。 単一時点刺激の場合、サンプルは 5 分後に採取されました。

刺激後、細胞は溶解され、以前に記載されているように、全溶解物サンプルがウェスタンブロッティングによって分析されました 33。 以下の抗体を使用しました: リン酸化 FGFR (1:1000、no. 3471S、Cell Signaling Technology)、リン酸化 FRS2α (1:1000、no. 3864S、Cell Signaling Technology)、リン酸化 PLCγ1 (1:1000、no. 2821S、Cell) Signaling Technology)、リン酸化 ERK1/2 (1:1000、no. 4370S、Cell Signaling Technology)、α-チューブリン (1:20000、no. 66031-1-Ig、Proteintech)、total-FGFR1 (1:1000、no. .9740S、Cell Signaling Technology）、total-FGFR2（1:1000、no. 23328S、Cell Signaling Technology）、total-FGFR3（1:1000、no. ab133644、Abcam）、total-FGFR4（1:1000、no. 8562S、Cell Signaling Technology）、HRP 結合ヤギ抗マウス IgG (H + L) (1:5000、no. SA00001-1、Proteintech)、HRP 結合ヤギ抗ウサギ IgG(H + L) (1:5000、 no.SA00001-2、プロテインテック）。 ブロットは、ChemiDoc XRS+ システム (Bio-Rad) または Amersham ImageQuant 800 (GE) による強化化学発光試薬 (番号 P10300、NCM Biotech Laboratories) を使用して展開しました。

エンドグリコシダーゼ H (Endo H) 感受性を使用して、FGFR のグリコシル化/成熟、ひいては細胞表面への輸送に対する細胞外ドメイン変異の潜在的な影響を分析しました。 イムノブロットでは、野生型 FGFR は、上部の拡散バンドと小さな鋭い下部バンドのダブレットとして移動します。 上のバンドは、ER 品質管理を通過し、細胞表面に正常に輸送された複合糖で修飾された、完全にグリコシル化された成熟 FGFR を表します。 一方、より速く移動する下部バンドは、ER に捕捉された不完全に処理された高マンノース型です。 受容体の成熟に影響を与える変異は、より速く移動する ER 内に存在するバンドの割合の増加として現れます。 マンノースに富む形態は、アスパラギン残基のすぐ近くにある 2 つの N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) サブユニット間の結合を切断する Endo H に対して感受性があります。 ただし、完全にグリコシル化された細胞表面に存在するバンドは、Endo H に対して耐性があります。したがって、FGFR の細胞表面存在量は、受容体を PNGase F で処理することによって決定される、受容体発現全体に対する Endo H 耐性画分の比率として表すことができます。この酵素は、複合糖含有量に関係なく、最も内側の GlcNAc とアスパラギンの間の結合を加水分解し、FGFR からそのすべての N-結合糖を完全に除去するアミダーゼです。 したがって、WTまたは変異体FGFR細胞株をNP-40溶解緩衝液(Biotime、番号P0013F、1mM PMSFを補充)中で4℃で15分間溶解させた。 まず、総タンパク質 20 μg (BCA アッセイで定量) を糖タンパク質変性緩衝液で 100 °C で 10 分間変性し、その後 500 単位の Endo H (New England Biolabs、no. P0702S) またはペプチド-N-グリコシダーゼ F で処理しました。 (PNGase F) (New England Biolabs、番号 P0704S) は製造者の指示に従ってください。 上で詳述したように、Endo H および PNGase F で処理したサンプルを FGFR アイソフォーム特異的抗体で免疫ブロットしました。

SEC で精製した FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 四次複合体の分子量は、確立されたプロトコル 6 に従って多角度光散乱によって決定されました。 実験前に、少なくとも 60 ml の脱気ランニングバッファー (150 mM NaCl を含む 25 mM HEPES pH 7.5) をシステムに通してカラムを平衡化し、光散乱検出器と屈折率検出器の安定したベースラインを確立しました。 次に、50 μl の精製 FGF23 – FGFR1c-αKlotho – HS 四次複合体 (1.5 mg ml-1) を Superdex 200 10/300 GL カラムに注入し、溶出液を 280 nm の吸光度、レーザー光の散乱および屈折率で継続的に監視しました。流量0.5 ml min-1で。 対照として、50μlの精製FGF23-FGFR-αKlotho三元複合体（1.5 mg ml-1）サンプルを同じ条件下で分析しました。 実験は周囲温度で行われました。 レーザー光の散乱強度と溶離液の屈折率の値を使用して、ASTRA ソフトウェア (Wyatt Technology Corp.) によって実装された分子量を導き出しました。

細胞を、12ウェル細胞培養皿内に配置された顕微鏡カバーガラス(番号WHB-12-CS-LC、WHB)上に1ウェルあたり1×105細胞で播種し、24時間接着させました。 翌日、細胞をPBSで3回洗浄し、血清を12時間欠乏させた。 FGF23WTおよびαKlothoectoによる20分間の共刺激後、細胞をPBSで3回洗浄し、PLAの前に30分間4%パラホルムアルデヒドで固定した。 ＰＬＡ反応は、製造業者の指示に従ってＤｕｏｌｉｎｋ ＰＬＡキット（番号ＤＵＯ９２１０１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して実施し、蛍光顕微鏡で視覚化した。 簡単に説明すると、スライドをブロッキング溶液で 37 °C で 60 分間処理し、洗浄バッファー A で 3 回リンスし、目的の各 FGFR アイソフォーム (FGFR1 ( 1:20、no. PA5-25979、ThermoFisher) ウサギ由来、FGFR1 (1:100、no. ab824、Abcam) マウス由来、FGFR2 (1:100、no. 23328S、Cell Signaling Technology)、ウサギ由来、FGFR2 (1 :50、no. sc-6930、Santa Cruz Biotechnology) マウス由来、FGFR3 (1:100、no. MA5-32620、ThermoFisher) ウサギ由来、FGFR3 (1:100、no. sc-13121、Santa Cruz Biotechnology)マウス、ウサギ由来の FGFR4 (1:100、番号 8562S、Cell Signaling Technology)、マウス由来の FGFR4 (1:100、番号 sc-136988、Santa Cruz Biotechnology))。 洗浄バッファー A で 3 回洗浄した後、スライドをオリゴ結合二次抗体 (Duolink 抗マウス マイナスおよび抗ウサギ プラス) とともに 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 スライドを洗浄バッファー A で再度リンスし、リガーゼ溶液に 37 °C で 30 分間浸漬して環状 DNA を形成させた後、ポリメラーゼ溶液と 37 °C で 100 分間インキュベートして暗室でローリングサークル増幅を行いました。 スライドを洗浄バッファー B で 10 分間ずつ 2 回リンスし、続いてバッファー B の 100 倍希釈液で 1 分間リンスしました。 画像解析のために、DAPI を含む最小限の量の Duolink PLA 封入剤を使用して、スライドをカバースリップで覆いました。 共焦点レーザー走査型顕微鏡（C2si、Nikon）を使用してスライドを検査した。

すべての統計分析は、GraphPad Prism 8.0 を使用して実行されました。 イムノブロットデータの統計分析には、3 つの独立した実験からの濃度測定値 (ImageJ を使用して決定) を使用しました。 PLA データの統計分析には、2 つの生物学的に独立した実験からランダムに選択された 6 つの顕微鏡視野からの多数の蛍光ドットと細胞 (手動でカウント) が使用されました。 図1および2のウェスタンブロッティングおよびPLAデータの処理。 2c、d、3b–d、および 4b、c は、二元配置 ANOVA に続いて Tukey を使用して実行されました。 一元配置分散分析とその後の Tukey を適用して、拡張データ図 3 のウェスタンブロッティングデータを処理しました。タンパク質精製は少なくとも 8 回繰り返され、同等の純度/量のサンプルが得られました。 ウエスタンブロッティング実験を生物学的に３回繰り返して実施し、同様の結果が得られた。 PLA アッセイを独立して少なくとも 2 回繰り返し、同様の結果が得られました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (EMD-34075、PDB: 7YSH)、FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (EMD-34082、PDB: 7YSU)、および FGF23–FGFR4–αKlotho–HS の電子密度マップと洗練されたモデル ( EMD-34084、PDB: 7YSW) 四級錯体は電子顕微鏡データ バンクに寄託されており、原稿が受理され次第公開されます。 生の切り取られていないウェスタンブロット画像は補足図1にまとめられています。ソースデータはこの論文に提供されています。

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リファレンスをダウンロードする

財政的支援は、中国国家重点研究開発プログラム（2017YFA0506000 to XL）、中国国家自然科学財団（82073705 & 82273842 to GC、82103999 to LC、81930108 to GL）、Ojiang Laboratory Startup Fund（OJQD2022007 to MM）、 Kungpeng Action Plan award (MM に)、浙江省自然科学基金 (LC に LR22H300002、LC に LQ22H300007)、温州主要科学技術イノベーション プロジェクト (GC に ZY2021023)、浙江省銭江人材計画 (GC に QJD1902016) および温州研究所 (UCAS) スタートアップ ファンド (WIUCASQD2021043、YW 宛)。

これらの著者は同様に貢献しました: Lingfeng Chen、Lili Fu、Jingchuan Sun、Zhiqiang Huang、Mingzhen Fang

中国温州市、温州医科大学薬学部、欧江研究室（再生医療、視覚、脳の健康のための浙江研究室）

Lingfeng Chen、Lili Fu、Jingchuan Sun、Zhiqiang Huang、Mingzhen Fang、Xin Liu、Junliang Lu、Zixiang Pan、Yang Wang、Xiaokun Li、Gaozhi Chen、Moosa Mohammadi

中国杭州市杭州医科大学薬学部

チェン・リンフェン & グアン・リャン

細胞成長因子研究所、欧江研究所（再生医療、視覚、脳の健康のための浙江研究所）、温州、中国

Lili Fu、Zhiqiang Huang、Mingzhen Fang、Xin Liu、Junliang Lu、Zixiang Pan、Gaozhi Chen、Moosa Mohammadi

中国温州市温州医科大学高分子医薬品および大規模調製のための国家重点実験室

リリー・フー＆シャオクン・リー

中国杭州市西湖大学生命科学部細胞運命制御研究室

スン・ジンチュアン

コロンビア大学アービング医療センター、生理学および細胞生物物理学科、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国

アレン・ジンクル

中国科学院大学温州研究所生物医学物理学センター（中国、温州）

ヤン・ワン

中国、温州市の温州医科大学、細胞成長因子医薬品およびタンパク質生物製剤の国立工学研究センター

リー・シャオクン

中国温州市の温州医科大学慢性腎臓病研究所

陳高志

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LC で四次複合体を発現、精製、調製し、サイズ排除クロマトグラフィーと多角光散乱分析を実行して構造図を作成しました。 LC と JS はクライオ EM グリッドを準備し、画像を収集して処理しました。 AZ は FGFR 細胞外ドメインを発現および精製しました。 LF は哺乳動物の発現構築物を生成しました。 JL は変異型 FGF23 タンパク質を発現しました。 LF、ZH、MF、XL、ZP、GC はウェスタンブロッティングと PLA データを生成し、関連する図を作成しました。 YW が生成した MD シミュレーション データ。 MM はプロジェクトを構想し、構造モデルを構築して分析し、原稿を書きました。 著者全員が原稿の議論と改訂に参加しました。

Xiaokun Li、Gaozhi Chen、または Moosa Mohammadi との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた黒尾誠氏とその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

受容体成分として FGFR1c (左)、FGFR3c (中央)、または FGFR4 (右) を含む FGF23-FGFR-αKlotho-HS 四次複合体の画像処理ワークフロー。 ゴールドスタンダード フーリエ シェル相関 (GSFSC) は、FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS、FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS、および FGF23-FGFR4-αKlotho-HS 四元錯体について、それぞれ 2.74、3.20、および 3.03 Å のグローバル分解能を示します。

A、垂直軸に沿った 90°回転によって関連付けられた 4 つの異なる配向における 1:2:1:1 FGF23-FGFR-αKlotho-HS 四元複合体の低温 EM 構造の漫画表示。 非対称四元錯体の平均寸法は 130 Å × 100 Å × 55 Å です。 FGFR 鎖の膜挿入点が近接している (約 25 Å 離れている) と、細胞内キナーゼ ドメインの非対称 A ループ トランスリン酸化二量体の形成が促進されると考えられます 27。 FGF23、αKlotho、HS はそれぞれオレンジ、青、マゼンタで示されています。 一次受容体 (FGFRP) と二次受容体 (FGFRS) は淡い緑色とシアンで示されています。 破線は、解釈可能な電子密度の欠如により構築できなかった、FGF23の三つ葉コアとその遠位αKlotho結合部位の間のリンカーであるFGF23の残基172〜182を示す。 この領域は、αKlotho または FGFR のいずれとも相互作用せず、おそらく無秩序または柔軟です。 注目すべきことに、この領域には、フリン型プロテアーゼ切断部位 (R179)、O-グリコシル化部位 (T178)、およびセリンリン酸化部位 (S180) を含む調節性サブチリシン様プロタンパク質転換酵素 (SPC) 部位 176RHT178R179/S180AE182 が存在します。 3 つの酵素、つまり GalNAc-T3 (N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ 3)、Fam20C (配列類似性 20 のファミリー、メンバー C)、およびまだ発見されていないフリン型プロテアーゼがこの部位に集まり、FGF23 プロセシングを制御します。 この領域の高い柔軟性は、これらの酵素の作用に必要であると考えられます。 B、FGF23 シグナル伝達は厳密に αKlotho に依存します。 L6-FGFR1cWT細胞を、漸増濃度の組換えFGF23WT単独、可溶性αKlothoと組み合わせて処理するか、未処理のまま放置した。 全細胞溶解物は図 2c のように免疫ブロットされました。 FGF23WTの薬理学的濃度を超えた濃度（10マイクロモルという高濃度）であっても、FGFR1cシグナル伝達を活性化できないことに注意してください。 ただし、可溶性 αKlotho と同時処理すると、わずか 10 nM の FGF23 で強力な FGFR1c 活性化が誘導されます。 実験は生物学的に三重に行われ、同様の結果が得られた。 C、FGF23 – FGFR1c – αKlotho 三元複合体（PDB ID: 5W21、緑色）の X 線構造を、1:2:1:1 のクライオ EM 構造内の対応する FGF23 – FGFR1cP – αKlotho 部分に重ね合わせたものFGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 四次複合体 (ピンク色) は、1.16 Å という高い類似性 (RM)D を示します。

a、L6-FGFR1cWT、L6-FGFR1cK175Q/K177Q (FGFR1cΔHBS1)、L6-FGFR1cK207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS2)、および L6-FGFR1cK175Q/K177Q/K207Q/R209Q (FGFR1cΔ) からの変性ライセートHBS1+2) 細胞をエンドグリコシダーゼ H (Endo) とインキュベートしました。 H) またはペプチド-N-グリコシダーゼ F (PNGase F)、または未処理のままにします。 サンプルを FGFR1c アイソフォーム特異的抗体で免疫ブロットしました。 免疫ブロットデータは、「方法」セクションに記載されているように定量され、平均±SDとして表示されます。 b〜d、FGFR1cWT、その4つのサイト2（FGFR1cE249A、FGFR1cR254A、FGFR1cI256A、FGFR1cY280A）および1つのサイト1（FGFR1cA170D/A171D/S219D）変異体（b）、野生型FGFR3cを安定的に発現するL6細胞株からの変性ライセート（ FGFR3cWT)またはその4つのサイト2変異体（FGFR3cE247A、FGFR3cR252A、FGFR3cI254A、FGFR3cY278A）（c）、野生型FGFR4（FGFR4WT）またはその4つのサイト2変異体（E243A、R248A、I250A、Y274A）（d）をEndo Hで処理し、 PNGase F または未処理のまま。 示されているように、サンプルを FGFR アイソフォーム特異的抗体で免疫ブロットしました。 実験は生物学的に三重に行われ、同様の結果が得られた。 定量は方法のセクションに記載されているように行い、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較事後検定によって決定された平均±SD P 値として表示されます。

ソースデータ

Ａ、左および中央：ＦＧＦＲＳおよびＦＧＦＲＰのＤ２ドメインのアラインメントを介して得られた配向で示される四次複合体のＦＧＦ２３－ＦＧＦＲＳおよびＦＧＦＲＰ－αＫｌｏｔｈｏコンポーネントの漫画表現。 右: 受容体の D3 ドメインの整列による FGF23-FGFRS および FGFRP-αKlotho コンポーネントの重ね合わせ。 FGF23 N末端とαKlotho RBAは、FGFRS鎖とFGFRP鎖のD3にある同等の疎水性溝に係合することに注意してください。 b〜d、FGF23のN末端は、FGF23-FGFR-αKlotho-HS四次複合体において大きな構造変化を起こします。 HS を含まない三元複合体 (つまり、X 線構造) (b) と HS 誘発四元複合体 (つまり、クライオ EM 構造) (c) を同じ方向に描いた漫画および表面 (FGF23 コンポーネントのみ) の表示FGF23 鎖のアラインメントによって得られます。 （ d ）FGF23 – FGFR1c – αKlotho三元複合体からのFGF23-FGFR1cと、FGF23アライメントを介した四次複合体からのFGF23-FGFR1cPの間のオーバーレイの漫画表示。 2 つの構造間の FGF23 N 末端の位置の劇的な違いに注目してください。 e、示された輪郭レベルでのFGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS四次複合体の低温EM構造におけるFGF23 N末端の電子密度。 FGF23 N 末端の電子密度は弱く、斑点があることに注意してください。 f〜i、MDシミュレーションデータは、FGF23のN末端がFGFR1cSのD3と結合していることを示しています。 f、左: FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS 四次複合体の低温 EM 構造の漫画表現。 FGF23、FGFR1cP、FGFR1cS、αKlotho はそれぞれオレンジ、緑、シアン、青です。 右: 300 ns MD シミュレーション軌跡における FGF23 の N 末端尾部 (つまり、Y25 から W36) と FGFR1cS の D3 の立体構造の進行を示すボックス領域 (左) の拡大図。 60 ns 間隔でオレンジ (0 ns) から青 (300 ns) に変化します。 FGF23 N 末端は、FGFR1cS D3 ドメインの 3 本鎖 βC: βF: βG シートと相互作用します。 gh、MD シミュレーション中の FGF23 の N 末端テールの RMSD (g) および二乗平均平方根変動 (RMSF、h) の変化。 FGF23 の N 末端残基の RMSD は 120 ns 後に約 4 Å で安定したことに注目してください。 重要なことに、FGF23 N末端の遠位端および近位端の残基は、それぞれ最大および最小のRMSFを示し、それぞれのクライオEM電子密度を反映していました(eとhを比較)。 i、FGF23のN末端残基とFGFR1cSのD3の残基間の4つの選択された接触ペア（Y25-L342S、S29-R254S、L31-A259SおよびL32-I256S）の距離の変化。 Y25-L342S、L31-A259S、および L32-I256S の疎水性残基ペアの距離は約 5 Å 変動し、これらの残基ペア間に疎水性接触が形成されていることを示しています。 同様に、S29-R254S のペア間距離は 120 ns 後に約 4 Å変動し、この残基ペアの側鎖間の水素結合を示しています。

ab、受容体相補性アッセイの理論的根拠。 中央: FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS 四元複合体の、Y 軸周りの 180 度回転によって関連付けられた 2 つの方向での漫画/表面表現。 円は、突然変異誘発のために選択された一次および二次受容体のリガンド結合部位のおおよその円周を示します。 a、左:二次受容体上の丸で囲んだ領域の拡大図。FGFR1cSのIle-203およびSer-223がFGF23のコアの残基と疎水結合および水素結合に関与していることを示しています。 右: 一次受容体上の丸で囲んだ領域の拡大図。FGFR1cP の Ala-167 および Val-248 が、それぞれ FGF23 の Tyr-124 および Leu-158 と高度に保存された疎水性接触に関与していることを示しています。 さらに、Ala-167 は Tyr-124 とも水素結合を形成します。 b、左、一次受容体上の丸で囲んだ領域の拡大図。FGFR1cPの対応するIle-203およびSer-223が溶媒にさらされていることを示しています。 したがって、操作されたFGFR1cI203E/S223E分子(すなわち、FGFR1cΔSLBS)は、二次受容体として機能する能力を失ったにもかかわらず、一次受容体として作用する能力を保存するはずである。 右、二次受容体上の丸で囲んだ領域の拡大図。FGFR1cS の対応する Ala-167 および Val-248 が四次複合体形成に何の役割も果たさず、溶媒にさらされていることを示しています。 したがって、操作されたFGFR1cA167D/V248D変異体(すなわち、FGFR1cΔPLBS)は、一次受容体として機能する能力を失うが、依然として二次受容体として機能し得ると予測される。 ｃ、ＰＬＡを介した、ＦＧＦＲ１ｃΔＳＬＢＳとＦＧＦＲ１ｃΔＰＬＢＳとの間、およびＦＧＦＲ４ΔＳＬＢＳとＦＧＦＲ１ｃΔＰＬＢＳとの間の受容体相補性の実証。 PLA を行った安定細胞株の代表的な蛍光顕微鏡視野を示します。 スケールバー、10μm。 実験は生物学的反復を少なくとも 2 回実行し、同様の結果が得られました。 ｄ、７つすべてのＦＧＦＲアイソフォームのリガンド結合領域（すなわち、Ｄ２、Ｄ２－Ｄ３リンカーおよびＤ３）の構造に基づく配列アラインメント。 ガイドとして、プロトタイプの FGFR の概略図が示され、そのさまざまなドメインが標識されています。 FGFR1-FGFR3 で選択的スプライシングを受ける D3 の C 末端半分が濃青色で強調表示されています。 D3 のスプライスされていない N 末端半分は、b アイソフォームと c アイソフォームの間で保存されていることに注意してください。 二次構造要素は配列の上部に提供されます。 HS 相互作用残基はすべて D2 ドメイン内に局在しており、マゼンタで色付けされています。 FGF23-FGFRP および αKlotho-FGFRP 界面を媒介する残基は、それぞれ黄色と緑色に色付けされています。 FGFRP-FGFRS の直接接触を媒介する残基 (水色) は、7 つのアイソフォームすべての間で完全に保存されていることに注意してください。 FGF23-FGFRS インターフェース (オレンジ色) に関しては、FGF23 のコアに接触する D2 残基のみが 7 つのアイソフォーム間で保存されています。 ただし、FGF23-FGFRS 界面で FGF23 N 末端と相互作用する 2 つの疎水性 D3 残基は、FGFR1c-3c および FGFR4 (黒い矢印で示す) でのみ保存されます。 FGFR1b-3bでは、αKlothoのRBAの結合部位と重複するこれらの残基が荷電残基に置き換えられています。 D3 グルーブ FGFR1b-3b の疎水性は、D3 グルーブ内に独特の N 結合型グリコシル化部位が存在することによってさらに破壊されます (赤いボックスで示されています)。 FGFR2cでは、重要な保存された疎水性残基が荷電したLys-296(赤色の下線)に置き換えられており、これがFGFR2cがαKlothoに結合できない原因であると考えられます。

a、リン酸化FGFR、PLCγ1、およびFRS2αに対する抗体でプローブした、FGFR1cWT、FGFR1cE249A、FGFR1cR254A、FGFR1cI256A、またはFGFR1cY280Aを安定的に発現する未処理またはFGF処理(1nM)未トランスフェクトおよびトランスフェクトL6細胞株からの全細胞抽出物のイムノブロット。 b、FGFR2bWT、FGFR2bE250A、FGFR2bR255A、FGFR2bI257A、またはFGFR2bY281Aを安定に発現する未処理またはFGF処理(FGF1については1nM、FGF3/7/10/22については2nM)処理済みの未トランスフェクトおよびトランスフェクトL6細胞株からの全細胞抽出物の免疫ブロット。 FGFR2b アイソフォーム特異的抗体 (上) またはパネル a のようなリン酸特異的抗体。 実験は生物学的に三重に行われ、同様の結果が得られた。

a、パラクリンFGF1/3/7/10およびHSに応答して、FGFR2bΔSLBSおよびFGFR2bΔPLBSが互いに補完し、1:1:1:1のFGF-FGFR2bΔSLBS-FGFR2bΔPLBS-HS非対称シグナル伝達複合体を形成できることを示す概略図。 即ち、ウェスタンブロッティングによる、FGFR2bΔSLBSとFGFR2bΔPLBSの間の受容体相補性の実証。 FGFR2bWT、FGFR2bΔPLBS、FGFR2bΔSLBSを単独で発現する、またはFGFR2bΔSLBSとFGFR2bΔPLBSを共発現するL6細胞株を、1 nM FGF1 (b)、2 nM FGF3 (c)、2 nM FGF7 (d)、または2 nM FGF10 (e)で処理しました。時間間隔を増やし、示されているように全細胞抽出物を免疫ブロットしました。 実験は生物学的に三重に行われ、同様の結果が得られた。

ａ、ＦＧＦ１またはＦＧＦ１０、ＨＳ、およびＦＧＦＲ１ｂΔＳＬＢＳ（一次受容体として機能する）が安定な複合体を形成し、その後二次受容体としてＦＧＦＲ２ｂΔＰＬＢＳを動員することを示す概略図。 ｂｃ、ＦＧＦＲ１ｂＷＴもしくはＦＧＦＲ１ｂΔＳＬＢＳを単独で発現する、またはＦＧＦＲ１ｂΔＳＬＢＳ＋ＦＧＦＲ２ｂΔＰＬＢＳを共発現するＬ６細胞株を、時間間隔を増加させながら１ｎＭ ＦＧＦ１（ｂ）または２ｎＭ ＦＧＦ１０（ｃ）で処理し、細胞抽出物を免疫ブロットした。 ｄ、ＨＳの存在下で、ＦＧＦ３およびＦＧＦＲ２ｂΔＳＬＢＳ（一次受容体として機能する）が安定な複合体を形成し、続いて二次受容体としてＦＧＦＲ３ｂＷＴを動員することを示す概略図。 e、FGFR3bWTを単独で発現する、またはそれをFGFR2bΔSLBSと共発現するL6細胞株を、時間間隔を増加させながら2nM FGF3で処理し、細胞抽出物を免疫ブロットした。 実験は生物学的に三重に行われ、同様の結果が得られた。

a、FGF ホルモンの HS 結合親和性が弱いため、HS 単独では内分泌 FGF-FGFR 複合体を安定化し、持続的な非対称受容体二量体化/活性化を誘導することができません。 ぼやけたり緩やかな結合は、推定上の FGF-FGFR-HS 三元複合体の不安定/一過性の性質と生理学的に重要ではない受容体の二量体化/活性化を強調するために使用されます。 b. 膜結合型 Klotho 共受容体は、FGFR の D3 ドメインと FGF の C 末端尾部に同時に結合し、それによって三元複合体内の内分泌 FGF-FGFR 複合体を安定化します。 そうすることで、Klotho 共受容体は、二成分内分泌 FGF-FGFR 複合体の安定化における HS の能力の欠如を効果的に補います。 HS は現在、安定化された二元複合体に 2 番目の FGFR を動員する位置にあり、非対称二量体化を誘導します。 それにもかかわらず、FGF ホルモンの HS 結合親和性が弱いため、Klotho および HS 誘導内分泌 1:2 FGF-FGFR 二量体は、寿命/安定性の点で HS 誘導パラクリン 1:2 FGF-FGFR 二量体よりも依然として劣っています (わずかなぼやけで示されています)。 b)のFGFRSの。 c. HS結合親和性が高いため、パラクリンFGFはHSを唯一の共受容体として依存して一次FGFRに安定に結合し、二次FGFRを動員することができ、それによって剛直で長寿命の非対称受容体二量体の形成を誘導することができる。

補足図。 1 ～ 4 および表 1 ～ 2。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Chen, L.、Fu, L.、Sun, J. 他 FGF ホルモンシグナル伝達の構造基盤。 自然 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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受信日: 2022 年 9 月 6 日

受理日: 2023 年 5 月 2 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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